[發明專利]快速檢測結核桿菌的電化學生物芯片傳感陣列及制備方法

在審

• 申請號: 201410068230.1
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN104878075A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 盛尚春;趙朝輝;謝國明;孫廣運;蔡苗;姜雄;逯心敏;雷開鍵;康怡;郭渝
• 申請（專利權）人: 宜賓市第二人民醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物電化學和生物芯片傳感技術領域，涉及一種結核分枝桿菌16S?_rDNA(核糖體DNA)的電化學生物芯片傳感陣列及其制備方法，用于檢測結核分枝桿菌。

背景技術

結核分支桿菌是引發肺結核的病原體，每年造成約200萬人死亡，同時也是誘發呼吸道感染疾病的重要因素，給人類健康帶來了巨大危害，全球結核患病人數以每年2％的速度快速增加，而我國結核病的發病人數居世界第二，感染率達到50％，是22個結核病高負擔國家之一。結核在低人均收入國家的發病率較高，最重要的原因之一是缺乏準確、可靠、便捷與成本低的診斷方法和技術。現今已有很多種TB檢測方法：(1)如結核分枝桿菌培養法，雖然具有很高的特異性和準確性，分離培養雖然準確度及敏感度均較高，但是最少需要幾周的時間才能夠得到結果；(2)結核分枝桿菌快速抗酸染色法敏感性較低，而且檢出率在不同感染背景人群中波動較大。(3)免疫層析檢測技術的特點是操作簡單，檢測速度較快；但是其檢測標志物種類單一，靈敏度及特異性均較低。

隨著結核分枝桿菌感染問題日益嚴重，對該菌的控制已成為世界性難題，建立快速、簡便、準確、靈敏及準確的結核分枝桿菌檢測方法是快速診斷的重要基礎。電化學生物傳感檢測技術具有檢測速度快、靈敏度高及可靠性強的優點，在結核致病菌檢測新技術中備受關注。

本發明從結核分枝桿菌16S?rDNA分子水平檢測入手，以四氧化三鐵二氧化硅(Fe3O4SiO2)復合納米粒子和納米Au結構材料為媒介體，設計新穎、功能化的納米電化學芯片生物傳感界面，同時以電化學生物芯片傳感陣列為依托，利用納米DNA生物分子探針體系，構建超順磁性納米檢測微球，對結核分枝桿菌進行雙重富集提取與純化檢測，構建一種用于結核分枝桿菌快速檢測的電化學生物芯片傳感陣列。

發明內容

本發明目的是提供一種可以靈敏、快速及定量檢測臨床標本中結核分枝桿菌16S?_rDNA的電化學生物芯片傳感陣列及其制備方法，其具體制備步驟如下：

步驟一：電化學生物芯片傳感陣列Fe₃O₄SiO₂磁性納米復合粒子及納米Au標記的DNA探針生物傳感層的制備；

步驟二：電化學生物芯片傳感陣列辣根過氧化物酶(HRP)、過氧化氫(H₂O₂)及納米Au標記的DNA檢測探針構成的級聯檢測信號放大體系的制備。

步驟一所述的電化學生物芯片傳感陣列Fe₃O₄SiO₂磁性納米復合粒子標記的DNA探針生物傳感層的制備，其特征在于：

(1)取Fe₃O₄磁流體，用無水乙醇清洗兩遍，然后用超聲波細胞破碎儀超聲分散均勻，移入三頸燒瓶中，加入氨水，將值調節pH在室溫下以均速攪拌；

(2)向Fe₃O₄磁流體混合液中逐滴加入適量正硅酸乙酯(TEOS)反應一定時間，反應后再次用無水乙醇清洗兩遍，再用超純水清洗兩遍，得到的褐色溶液，再用濃鹽酸浸泡該磁流體一周時間，將未被包裹的Fe₃O₄磁球除去，然后用超純水清洗即Fe₃O₄SiO₂磁性納米復合粒子；

(3)將電化學生物芯片在雙蒸水中清洗兩次，烘干；將液體池覆蓋在電化學生物芯片表面后，一起放入電化學生物芯片反應池中；

(4)分別對應電化學生物芯片的16個反應單元中加入Fe₃O₄SiO₂磁性納米復合粒子修飾的結核分枝桿菌檢測DNA探針，然后將含有電化學生物芯片的反應池放入到充滿氮氣的電化學生物芯片孵育盒中孵育后，取出用無水乙醇輕輕清洗，并在氮氣中烘干；

(5)分別對應電化學生物芯片的16個反應單元中加入結核分枝桿菌標本預處理混合液后放入電化學生物芯片孵育盒中。

步驟二所述的化學生物芯片傳感器陣列辣根過氧化物酶(HRP)、過氧化氫(H₂O₂)、四甲基聯苯安(TMB)及納米Au標記的結核分枝桿菌DNA檢測探針構成的級聯檢測信號放大體系的制備，其特征在于：

(1)分別對應電化學生物芯片的16個反應單元中加入納米Au標記的結核分枝桿菌DNA檢測探針，孵育后取出用PBS輕輕沖洗；