[發明專利]用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201410067919.2
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103820553A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 葉輝銘;蘇曉崧;張忠英
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院;葉輝銘
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明屬于分子生物學檢驗領域，涉及華法林，尤其涉及一種用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒及其檢測方法。

背景技術

華法林是一種雙香豆素衍生物，華法林通過抑制維生素K及其2，3-環氧化物(維生素K環氧化物)的相互轉化而發揮抗凝作用。雖為最古老的口服抗凝藥物，華法林仍然是目前需要長期抗凝治療患者的最常用藥物^[1]。華法林的臨床應用包括靜脈血栓栓塞性疾病(VTE)的一級和二級預防、心房顫動(房顫)血栓栓塞的預防、瓣膜病、人工瓣膜置換術和心腔內血栓形成的預防等^[2,3]。非瓣膜病房顫研究薈萃分析顯示，華法林可使卒中的相對危險度降低64％，全因死亡率顯著降低26％^[4]。但是，華法林臨床應用存在有效血藥濃度范圍狹窄和個體間穩定劑量差異顯著（不同患者個體間劑量差異可達數十倍）兩大問題。這兩個問題直接導致出血或血栓形成等副作用的發生：在美國，華法林的致死性副反應一度居所有藥物之首^[5]。

造成華法林個體劑量差異的原因包括非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳因素主要指身高、年齡、體重、飲食、藥物相互作用等，非遺傳因素是華法林用藥劑量差異的次要原因。遺傳因素是影響華法林個體劑量差異的關鍵因素。其中最重要的遺傳因素為與華法林藥效動力學和藥代動力學相關的酶或靶蛋白的基因發生變異導致此關鍵酶或靶蛋白的含量或活性的變化，進而增強或降低華法林的敏感性，影響到華法林的劑量。

華法林代謝的關鍵酶為細胞色素P450超家族的第二亞家族的CYP2C9蛋白，該酶將華法林代謝為無活性成分，并且已知CYP2C9基因單核苷酸多態性對華法林用藥劑量的個體差異有顯著影響^[6]。CYP2C9包含CYP2C9*1—CYP2C9*15等多種基因型，而其中的CYP2C9*2（rs1799853）和CYP2C9*3（rs1057910）基因型對華法林代謝影響最大。例如，CYP2C9*3的1075A>C突變導致該酶359位氨基酸由異亮氨酸變為亮氨酸，酶活性失活（突變型酶活性僅為野生型5%），導致華法林的清除率低于正常，血藥濃度升高。因此，此類人群需要降低臨床用藥劑量，以防止藥物過量導致的出血等不良反應的發生。華法林作用的靶蛋白為維生素K還原酶復合物（VKORC），該酶正常的生理功能為將環氧化形式的維生素K轉化為氫醌形式，后者則在維生素K依賴的凝血因子FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活化中起重要作用。同樣的，編碼VKORC蛋白的VKORC1基因的SNP多態性也會導致VKORC酶的活性改變，進而影響到華法林的抗凝效果，并且在亞洲人群VKORC1對華法林劑量的影響更為重要，可達16—30%^[7]。其中又以VKORC1基因啟動子區-1639G>A（rs9923231，也被稱為VKORC1*2基因型）最為重要，G基因型比A基因型的酶活性高40%，因此A基因型突變時華法林劑量較G基因型要低。

可見CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多態性是影響華法林個體劑量差異的主要因素。而且基于這些基因多態性位點的檢測以分層用藥劑量或聯合患者的身高、體重等信息做的劑量預測方程預測具體劑量以在有檢測條件的發達國家和地區應用，并表現了優于傳統固定劑量給藥方式的高療效和低副作用^[8,9]。目前檢測上述華法林個體化劑量相關基因多態性的方法較多，包括實時熒光PCR法、限制性內切酶片段多態性分析（RFLP）、基因芯片、Sanger測序法、普通PCR聯合電泳分析等等，但是這些方法存在靈敏度不夠、耗時、交叉污染和成本昂貴等問題。

焦磷酸測序技術是基于實時反應、邊合成邊測序的新型核酸序列分析技術，該技術具有操作簡便、檢測成本較低、快捷、準確、可高通量，同時也無需熒光標記和電泳分析等操作，非常適合臨床檢驗的用途。本發明即是基于焦磷酸測序技術進行華法林個體化治療劑量相關基因多態性檢測試劑盒的開發和應用。

參考文獻：

1、中華醫學會心血管病學分會，中國老年學學會心腦血管病專業委員會.華法林抗凝治療的中國專家共識.中華內科學雜志.2013;52:76-82.