[發明專利]用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201410067919.2
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103820553A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 葉輝銘;蘇曉崧;張忠英
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院;葉輝銘
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒，其特征在于包括：

（1）全血基因組DNA提取試劑：所述全血基因組DNA提取試劑來源于商品化的血液基因組提取試劑盒，成分有緩沖液GD、緩沖液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脫緩沖液TB；

（2）多重PCR擴增引物：所述多重PCR擴增引物包括：

PCR引物1（Seq?NO1）：

VKORC1-1639G>A（rs9923231）上游引物5’-GGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCT-3’；

PCR引物2（Seq?NO2）：

VKORC1-1639G>A（rs9923231）下游引物5’-GCCTCCAGGGTTCAAGTGG-3’；

PCR引物3（Seq?NO3）：

CYP2C9*2（rs1799853）上游引物5’-TACAGAGCTCCTCGGGCAGA-3’；

PCR引物4（Seq?NO4）：

CYP2C9*2（rs1799853）下游引物5’-CAGCGGGCTTCCTCTTGA-3’；

PCR引物5（Seq?NO5）：

CYP2C9*3（rs1057910）上游引物5’-TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3’；

PCR引物6（Seq?NO6）：

CYP2C9*3（rs1057910）下游引物5’-GGGGACTTCGAAAACATGG-3’；

其中引物2、引物4、引物5的5’端均進行生物素標記；

（3）多重PCR擴增反應試劑：所述多重PCR擴增反應試劑名為“2X?PyroMark?PCR?Master?Mix”，PyroMark?PCR?Kit試劑盒，成分包括熱啟動Taq?DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鎂離子Mg²⁺、鈉離子Na⁺以及擴增反應特異性增強劑Q-Solution；

（4）單鏈DNA分離和純化試劑：所述單鏈DNA分離和純化試劑包括鏈霉親和素瓊脂糖、PyroMark結合緩沖液、PyroMark變性溶液和PyroMark洗脫緩沖液10X濃縮液；

（5）焦磷酸測序引物：所述焦磷酸測序引物包括：

測序引物1（Seq?NO7）：

VKORC1-1639G>A（rs9923231）測序引物5’-CCTGAAAAACAACCATTG-3’；

測序引物2（Seq?NO8）：

CYP2C9*2（rs1799853）測序引物5’-GAGGAGCATTGAGGAC-3’；

測序引物3（Seq?NO9）：

CYP2C9*3（rs1057910）測序引物5’-TGGGGAGAAGGTCAA-3’；

（6）焦磷酸測序試劑：所述焦磷酸測序試劑為DNA焦磷酸測序的常規試劑，包括PyroMark退火緩沖液、酶復合物、底物復合物和脫氧核糖核苷三磷酸復合物dNTP，其中dATP為人工修飾的α-硫代脫氧腺苷三磷酸，其余脫氧胞苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胸苷三磷酸未修飾；所述酶復合物為焦磷酸測序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶；底物復合物為腺苷-5’-磷酸硫酸酐；

（7）盒體：全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴增引物、多重PCR擴增反應試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑設在盒體內。

2.用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序的檢測方法，其特征在于采用如權利要求1所述用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒，包括如下步驟：

（1）人類全血基因組DNA提取：采用所述一種用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒的全血基因組DNA提取部分試劑，包括利用緩沖液GB和蛋白酶K溶解外周血白細胞，緩沖液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脫液TB洗脫得到DNA成分，整個提取反應以吸附柱CB3為DNA與細胞碎片和DNA與蛋白質分離的介質；

（2）多重PCR擴增反應：采用所述一種用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒的多重PCR引物和多重PCR擴增反應試劑，具體的反應體系和反應條件如表1和表2所示；

表1多重PCR擴增反應體系

表2多重PCR擴增反應條件

反應步驟反應溫度（℃）反應時間備注PCR反應激活9515min3個循環變性9430s45個循環退火5230s?延伸7230s?最終延伸7210min?

（3）單鏈DNA樣本分離和純化：采用所述一種用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒的單鏈DNA分離和純化試劑，包括在PyroMark結合緩沖液條件下高性能鏈霉親和素瓊脂糖與帶生物素的PCR產物的結合，而分離出單鏈DNA產物，然后分別經過70%乙醇、PyroMark變性溶液和PyroMark洗脫緩沖液得到純化的單鏈DNA樣本；

（4）焦磷酸測序與結果分析：采用所述一種用于指導華法林個體化用藥的多重PCR聯合焦磷酸測序試劑盒的焦磷酸測序引物和焦磷酸測序試劑，具體操作為分別在25μL用PyroMark退火緩沖液稀釋至0.3μmol/L的測序引物1、測序引物2和測序引物3中放入已純化的單鏈DNA產物，經過80℃持續加熱2min后，15～25℃下冷卻至少5min，同時在PyroMarkQ24試劑倉中加入系統計算所得的酶復合物、底物復合物和四種脫氧核糖核苷三磷酸的各自體積量，然后在PyroMark?Q24儀器上運行測序程序，最后測序結束后在PyroMark?Q24分析軟件運行AQ模式進行結果分析。