[發(fā)明專(zhuān)利]一種損傷DNA-納米金復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410067262.X
• 申請(qǐng)日: 2014-02-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104861037A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪福意;杜支鳳;羅群;郭偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C07K1/14
• 分類(lèi)號(hào): C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 北京潤(rùn)平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 李婉婉;張苗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)富集、分離和檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及一種損傷DNA-納米金復(fù)合物及其制備方法，該損傷DNA-納米金復(fù)合物捕獲藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白的方法，以及該損傷DNA-納米金復(fù)合物在藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白的捕獲和/或鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

以順鉑為代表的鉑類(lèi)抗腫瘤藥物是細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的典型代表。自1969年Rosenberg發(fā)現(xiàn)順鉑（Cisplatin）抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性以來(lái)，順鉑已成為臨床上使用最為廣泛的抗腫瘤藥物，第二代鉑類(lèi)藥物卡鉑、奧沙利鉑等也已相繼進(jìn)入臨床使用。順鉑進(jìn)入人體后，可擴(kuò)散通過(guò)帶電的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，在染色質(zhì)內(nèi)和DNA形成一種鏈內(nèi)交聯(lián)復(fù)合物。高遷移率族蛋白1（HMGB1，high?mobility?group?protein1）能特異性地結(jié)合順鉑與DNA形成的1,2-d(GpG)鏈內(nèi)交聯(lián)產(chǎn)物，阻止核酸切割酶對(duì)DNA的修復(fù)，抑制DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。

迄今為止，人們對(duì)不同腫瘤細(xì)胞對(duì)金屬抗腫瘤藥物DNA損傷的分子應(yīng)答機(jī)制及其差異還知之甚少。所以，從分子水平上研究DNA結(jié)合蛋白與損傷DNA-藥物復(fù)合物的相互識(shí)別和相互作用，以及這種分子識(shí)別作用對(duì)細(xì)胞藥物應(yīng)答靈敏度的影響，對(duì)深入理解細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的作用機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化它們的分子設(shè)計(jì)具有非常重要的意義，也是藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域所面臨的最具挑戰(zhàn)性的課題之一。

目前，捕獲鉑損傷DNA應(yīng)答蛋白的方法包括：將含有光捕獲基團(tuán)的鉑損傷DNA負(fù)載到磁珠表面或者將鉑損傷DNA負(fù)載到糖球表面與大量的核蛋白溶液孵育以捕獲應(yīng)答蛋白。這些方法的主要不足是：由于磁珠或糖球等材料不溶于水，結(jié)合過(guò)程為非均相結(jié)合，所以需要使用大量的腫瘤細(xì)胞裂解液；而且沒(méi)有設(shè)置對(duì)照，易將非特異性捕獲的蛋白質(zhì)作為應(yīng)答蛋白；而且由于引入了光捕獲試劑，鉑損傷DNA的結(jié)構(gòu)并不是生理?xiàng)l件下的結(jié)構(gòu)，因此捕獲的蛋白不一定是生理?xiàng)l件下的應(yīng)答蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)需要大量細(xì)胞裂解液且特異性較低的缺陷，提供一種使用少量細(xì)胞裂解液即可實(shí)現(xiàn)捕獲且特異性高的損傷DNA-納米金復(fù)合物及其制備方法、該損傷DNA-納米金復(fù)合物捕獲藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白的方法以及該損傷DNA-納米金復(fù)合物在藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白的捕獲和/或鑒定中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種損傷DNA-納米金復(fù)合物，該損傷DNA-納米金復(fù)合物中，1摩爾的納米金上結(jié)合有7-12摩爾的藥物損傷的雙鏈DNA。

第二方面，本發(fā)明提供了一種制備第一方面所述的損傷DNA-納米金復(fù)合物的方法，該方法包括將藥物損傷的雙鏈DNA與納米金接觸，以使藥物損傷的雙鏈DNA與納米金相連。

第三方面，本發(fā)明提供了由第二方面所述的方法制得的損傷DNA-納米金復(fù)合物。

第四方面，本發(fā)明提供了一種捕獲藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白的方法，該方法包括以下步驟：

（1）將第一方面和/或第三方面所述的損傷DNA-納米金復(fù)合物（也稱(chēng)為陽(yáng)性探針）、沒(méi)有被藥物損傷的對(duì)照DNA-納米金復(fù)合物（也稱(chēng)為對(duì)照探針）與細(xì)胞裂解液混合，以使損傷DNA-納米金復(fù)合物與藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白結(jié)合，所述對(duì)照DNA-納米金復(fù)合物中，1摩爾的納米金上結(jié)合有7-12摩爾的雙鏈DNA，所述對(duì)照DNA-納米金復(fù)合物中的雙鏈DNA與所述損傷DNA-納米金復(fù)合物中的藥物損傷的雙鏈DNA的堿基序列相同；

（2）除去未結(jié)合的蛋白，從而分離出捕獲的蛋白；

（3）鑒定捕獲的蛋白；

（4）應(yīng)用基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)捕獲的蛋白進(jìn)行定量比較，排除非特異性的DNA結(jié)合蛋白，從而得到特異性識(shí)別藥物損傷DNA的應(yīng)答蛋白。

第五方面，本發(fā)明提供了第一方面和/或第三方面所述的損傷DNA-納米金復(fù)合物在藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白的捕獲和/或鑒定中的應(yīng)用。

通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明的損傷DNA-納米金復(fù)合物僅需要少量細(xì)胞裂解液即可實(shí)現(xiàn)藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白的捕獲，且蛋白捕獲特異性高。此外，將本發(fā)明的損傷DNA-納米金復(fù)合物用于捕獲藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白時(shí)，通過(guò)簡(jiǎn)單的離心步驟即可將捕獲的藥物損傷DNA應(yīng)答蛋白與其他蛋白分離，簡(jiǎn)化了操作。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：