[發明專利]一種改進的莖環引物qRT-PCR檢測miRNA的方法

有效

• 申請號: 201410067044.6
• 申請日: 2014-02-26
• 公開（公告）號: CN103866009A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 薛慧慧;肖君華;周宇荀;李凱
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種改進的莖環引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，包括：

（1）miRNA檢測引物的設計：

莖環引物包括兩部分，通用的莖環序列和與靶標miRNA3’端互補配對的特異引物序列，其中與靶標miRNA互補配對的堿基數為11bp；

qPCR的下游引物針對通用的莖環序列，上游引物針對靶標miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火溫度相近；

（2）采用步驟（1）設計的miRNA檢測引物將靶標miRNA反轉錄成cDNA；

（3）定量PCR擴增并采用SYBR?Green?qPCR檢測法進行檢測。

2.根據權利要求1所述的一種改進的莖環引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的靶標miRNA為miR-505-3P-RT¹、miR-505-3P-RT²或miR-16-RT。

3.根據權利要求2所述的一種改進的莖環引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于：所述的miR-505-3P-RT¹對應的miRNA檢測引物為：

PCR-F¹:GCGAGCACCGTCAACACTTG;PCR-R¹:TGGTGTCGTGGAGTCGGC。

4.根據權利要求2所述的一種改進的莖環引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于：所述的miR-505-3P-RT²對應的miRNA檢測引物為：

PCR-F²:GCGAGCACCGTCAACACT,PCR-R²:TGGTGTCGTGGAGTCGGC。

5.根據權利要求2所述的一種改進的莖環引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于：所述的miR-16-RT對應的miRNA檢測引物為：

PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT。

6.根據權利要求1所述的一種改進的莖環引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，其特征在于：步驟（3）中所述的PCR擴增中PCR反應終體系20μL包括：10μL2×SYBR?Green?PCR?master?mix，0.4μL?ROX，2.5μL?cDNA模板，3μL?PCR上下游引物2μM,4.1μL水，同時設陰性對照；PCR循環條件為95℃預變性2min，95℃變性15s，62℃延伸32s，共40個循環。