[發(fā)明專利]一種改進(jìn)的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410067044.6
• 申請日: 2014-02-26
• 公開（公告）號: CN103866009A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛慧慧;肖君華;周宇荀;李凱
• 申請（專利權(quán)）人: 東華大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于miRNA的檢測方法領(lǐng)域，特別涉及一種改進(jìn)的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法。

背景技術(shù)

MicroRNAs（miRNAs）是一類由大約22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，主要通過信使RNA的直接剪切或間接抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。MicroRNAs在個體發(fā)育的不同時期如細(xì)胞分化、增殖、凋亡等及不同組織中有不同的表達(dá)模式，表明其在發(fā)育和分化中起著重要的調(diào)控作用。

傳統(tǒng)的miRNA檢測技術(shù)如northern?hybridization，microarray，對低豐度的miRNA的擴(kuò)增敏感性差。qRT-PCR(Quantitative?reverse?transcription?PCR)法是檢測基因表達(dá)量最靈敏、可靠的方法，但常規(guī)的qRT-PCR技術(shù)難以檢測約22bp的miRNAs，為克服這個問題，開發(fā)了莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄法、poly-A加尾法等。通過延長逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度，便于qPCR引物設(shè)計，以利于PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。

Chen等開發(fā)的Taqman探針qRT-PCR檢測法，采用基因特異的莖環(huán)引物，增強(qiáng)了RNA-DNA雜化雙鏈的熱穩(wěn)定性，及莖環(huán)引物所產(chǎn)生的空間約束，使逆轉(zhuǎn)錄具有較高的靈敏性和特異性。但此方法成本較高，且Taqman探針只結(jié)合到逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分cDNA序列無法完全保證其特異性，亦無法通過融解曲線分析PCR反應(yīng)的特異性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種改進(jìn)的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，該方法特異性好、靈敏性高，且只需合成一種下游引物，采用SYBR?Green?I熒光染料法，大大節(jié)約了技術(shù)成本。

本發(fā)明的一種改進(jìn)的莖環(huán)引物qRT-PCR檢測miRNA的方法，包括：

（1）miRNA檢測引物的設(shè)計：

莖環(huán)引物包括兩部分，通用的莖環(huán)序列和與靶標(biāo)miRNA3’端互補(bǔ)配對的特異引物序列，其中與靶標(biāo)miRNA互補(bǔ)配對的堿基數(shù)為11bp；

qPCR的下游引物針對通用的莖環(huán)序列，上游引物針對靶標(biāo)miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火溫度相近；

（2）采用步驟（1）設(shè)計的miRNA檢測引物將靶標(biāo)miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

（3）定量PCR擴(kuò)增并采用SYBR?Green?qPCR檢測法進(jìn)行檢測。

步驟（1）中所述的靶標(biāo)miRNA為miR-505-3P-RT¹、miR-505-3P-RT²或miR-16-RT。

所述的miR-505-3P-RT¹對應(yīng)的miRNA檢測引物為：

PCR-F¹:GCGAGCACCGTCAACACTTG;PCR-R¹:TGGTGTCGTGGAGTCGGC.

所述的miR-505-3P-RT²對應(yīng)的miRNA檢測引物為：

PCR-F²:GCGAGCACCGTCAACACT,PCR-R²:TGGTGTCGTGGAGTCGGC.

所述的miR-16-RT對應(yīng)的miRNA檢測引物為：

PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT.

步驟（3）中所述的PCR擴(kuò)增中PCR反應(yīng)終體系20μL包括：10μL2×SYBR?Green?PCR?master?mix，0.4μL?ROX，2.5μL?cDNA模板，3μL?PCR上下游引物2μM,4.1μL水，同時設(shè)陰性對照；PCR循環(huán)條件為95℃預(yù)變性2min，95℃變性15s，62℃延伸32s，共40個循環(huán)。

本發(fā)明基于莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄和SYBR?Green?qPCR檢測法，將Taqman探針改為SYBRGreen熒光染料（百泰克），并通過優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的長度，建立改進(jìn)的莖環(huán)引物RT-PCR實時定量檢測方法。