[發明專利]基于dCAPS技術對日本看麥娘抗藥性相關突變的分子檢測方法

無效

• 申請號: 201410066925.6
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103882121A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 董立堯;徐洪樂;李俊;潘浪
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于衍生酶切擴增多態性(derived?cleaved?amplified?polymorphic?sequence，dCAPS)方法來檢測導致日本看麥娘對乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl?coenzyme?A?carboxylase，ACCase)抑制劑類除草劑產生抗性的相關突變的分子檢測方法。可用于對日本看麥娘抗性相關突變進行快速準確的檢測。

背景技術

日本看麥娘(Alopecurus?japonicus?Steud.)是我國油菜田和麥田的惡性禾本科雜草，因其與作物爭肥、爭水、爭陽光、爭空間，而對油菜和小麥的產量及品質造成嚴重危害。

ACCase抑制劑類除草劑是一類包括芳氧苯氧基丙酸酯類，環己烯酮類，新苯基吡唑啉類的具有殺草活性高、殺草譜廣和選擇性強等優點的除草劑。自70年代后期在我國油菜田和小麥田開始廣泛使用，一直是油菜田和小麥田防除一年生禾本科雜草的主導藥劑。但是近年來，日本看麥娘對此類除草劑的抗藥性問題逐步顯現，對我國油菜和小麥的糧食生產生了嚴重威脅。因此，對日本看麥娘的抗藥性檢測對于保障我國糧食生產安全至關重要。研究表明，在日本看麥娘中編碼ACCase氨基酸的某些位點突變會導致其對ACCase抑制劑類除草劑產生抗藥性，這些氨基酸突變為Ile-1781-Leu，Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu，Trp-2027-Cys，Ile-2041-Asn，Asp-2078-Gly。

對抗性相關突變的檢測對于抗性日本看麥娘的監控及治理具有重要意義。dCAPS技術是一種通過等位基因快速準確檢測SNP位點的技術。該技術通過在引物中導入錯配堿基，使擴增的序列在一種基因型中產生酶切位點，而在另一種沒有，PCR產物再經過相應的限制性內切酶酶切，通過限制性圖譜分析可知SNP位點是否存在，從而對突變位點進行快速準確的檢測。該技術已經在其他抗性雜草的抗性突變檢測中得到了應用，但是在我國惡性雜草日本看麥娘的抗性檢測中尚無應用。

發明內容

為了對日本看麥娘抗ACCase抑制劑類除草劑的抗性相關突變進行檢測，本發明建立了一套基于dCAPS技術對抗性相關突變進行快速準確檢測的分子檢測方法。為實現該方法，本發明針對不同突變設計了相應的引物，篩選了合適的限制性內切酶，并對PCR擴增條件、瓊脂糖凝膠電泳條件進行了優化。

本發明所述分子檢測方法通過以下技術方案實現：

(1)根據日本看麥娘編碼ACCase基因中與抗性相關的不同的突變位點，分別設計一對引物進行PCR擴增，使擴增產物在不同的基因型之間產生不同的酶切位點。

PCR擴增所用的引物為：

(2)用相應的限制性內切酶對PCR擴增產物進行酶切。

酶切所用的限制性內切酶為：

(3)酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對電泳圖譜分析便可明確是否產生了抗性突變。

對Ile-1781-Leu突變的檢測中，敏感基因型產生可見的320bp條帶，抗性純合突變產生可見的271bp和不可見的49bp條帶，抗性雜合突變產生可見的320bp、271bp條帶和不可見的49bp條帶；對Trp-1999-Cys突變的檢測中，敏感基因型產生可見的359bp和不可見的47bp條帶，抗性純合突變產生可見的406bp條帶，抗性雜合突變產生可見的406bp、359bp條帶和不可見的47bp條帶；對Trp-1999-Leu突變的檢測中，敏感基因型產生可見的390bp條帶，抗性純合突變產生可見的349bp和不可見的41bp條帶，抗性雜合突變產生可見的390bp、349bp條帶和不可見的41bp條帶；對Trp-2027-Cys突變的檢測中，敏感基因型產生可見的317bp條帶，抗性純合突變產生可見的267bp和不可見的50bp條帶，抗性雜合突變產生可見的317bp、267bp條帶和不可見的50bp條帶；對Ile-2041-Asn突變的檢測中，敏感基因型產生可見的391bp條帶，抗性純合突變產生可見的351bp和不可見的40bp條帶，抗性雜合突變產生可見的391bp、351bp條帶和不可見的40bp條帶；對Asp-2078-Gly突變的檢測中，敏感基因型產生可見的331bp條帶，抗性純合突變產生可見的283bp和不可見的48bp條帶，抗性雜合突變產生可見的331bp、283bp條帶和不可見的48bp條帶。