[發明專利]一種分離培養海馬神經細胞的方法及其專用培養液

有效

• 申請號: 201410066560.7
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103789268A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 劉洛賢
• 申請（專利權）人: 劉洛賢
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種海馬神經細胞分離與原代培養方法及試劑。

背景技術

海馬(hippocampal)是中樞神經系統的重要組成部分，作為神經元高度集中的區域，具有中樞神經系統的典型特性，在學習、記憶、情緒反應及自主神經功能等方面發揮重要作用。神經元細胞培養模型是研究神經元發育分化、神經再生、神經疾病的發生機制等重要的實驗模型，體外培養海馬神經元已成為研究阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病的重要技術手段。原代培養(primary?culture)是指從活體細胞獲得細胞、組織或器官，在體外條件下進行的第一次培養。神經元原代培養是將胚胎哺乳動物中樞神經系統的部分組織，如海馬組織、大腦皮層、小腦、下丘腦、海馬、脊髓和神經叢從機體直接取出，再接種培養的方法。目前國內、外有關神經元培養的方法較多，但在原代培養中神經元的純度和產量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經元是一種高度分化的細胞，動物出生后很少分裂，相對于其它細胞而言，神經元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養神經元要求的培養方法和營養條件均較為特殊。

目前，導致難以獲得足夠數量和活力的原代海馬神經元的因素有以下幾方面：(1)海馬神經組織分離過程中，多數人用D-hank′s或hank′s作為漂洗液，離體哺乳動物海馬組織中去除紅細胞、被膜及結締組織等雜質，分離過程時間較長，有時候需要2小時以上，在漂洗液中時間會更長，海馬神經元即已部分死亡，從而出現假陰性的培養結果。實驗上無法開展海馬神經元的常規培養，主要可能是因為沒有合適的用于海馬組織標本的神經元培養用漂洗液／解剖液之故。在組織分離過程中，即使冰浴，神經元依然進行著很大程度代謝，hank′s液的無糖環境對神經元分離很不利，在hank′s液中添加DMEM或者高糖來供給大腦的代謝，但葡萄糖濃度太高，易增加細菌污染的機會；添加DMEM培養液會堿性化，不利于神經元細胞存活。中國專利CN102978162A“一種神經元分離和培養方法及試劑”、中國專利CN102994452A“一種高效分離和培養神經元的方法”和中國專利CN102994451A“一種神經元分離和培養的改進型方法”，取腦組織放入盛有1×PBS的培養皿中，所采用清洗液均為PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，考慮到了神經元能量代謝需要，但未添加任何抗菌物質，葡萄糖濃度太高，就容易增加細胞污染的機會。(2)采用大劑量胰蛋白酶消化后，海馬神經細胞勢必受到相當程度的生比和機械損害；細胞表面的粘附分子或膜蛋白極易受到破壞，對于這類具有立體結構用以維持細胞增殖及自我更新的細胞來說，很難迅速恢復細胞狀態，往往伴隨著大范圍的細胞死亡／凋亡，細胞“老化”嚴重，細胞活力將明顯減弱，組織中不能獲得大量活細胞；(3)細胞種植液對原代培養海馬神經元至關重要，細胞種植液不同于接下來的細胞維持液，需要給予神經細胞特殊的生長因子，這樣才能保證獲得足夠數量和活力的海馬神經元。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，本發明提供了一種哺乳動物的海馬神經元體外原代培養的方法，目的是建立一種簡單易行、高純度的海馬神經元體外原代培養的方法及試劑，滿足神經科學研究的需求。

本發明提供的技術方案之一為：

本發明的長雙歧桿菌(Bifidobacterium?longum)LJM002，已于2011年05月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為長雙歧桿菌(Bifidobacterium?longum)，保藏編號為CGMCC?No.4900。

本發明的長雙歧桿菌LJM002分離于一名浙江省健康青年人糞便中。

本發明的長雙歧桿菌LJM002菌株具有下述微生物學特征：

(1)菌落形態：長雙歧桿菌LJM002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質地軟、邊緣整齊，直徑1～1.5mm。

(2)個體形態：G⁺無芽孢桿菌，桿狀。