[發明專利]一種分離培養海馬神經細胞的方法及其專用培養液

有效

• 申請號: 201410066560.7
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103789268A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 劉洛賢
• 申請（專利權）人: 劉洛賢
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種海馬神經元的分離和原代培養方法包括以下步驟：?

(1)漂洗：取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細胞、被膜及結締組織，用漂洗液沖洗2～5次；?

(2)消化：將步驟1漂洗后的海馬組織剪成直徑1mm³小塊，用5倍組織體積的消化液37℃作用5～10分鐘，組織成粥糜狀，用細胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細胞。?

(3)制備細胞懸液：收集步驟2消化后初次細胞懸液，經200目細胞篩過濾后，800～1000rpm4℃離心5～10分鐘，棄去上清液，加入細胞種植液，重懸細胞，制成5×10⁵～10×10⁵個／mL的單細胞懸液；?

(4)接種、培養：將步驟3細胞懸液種植于預先鋪好多聚賴氨酸的培養皿及培養瓶中，置于37℃、5％CO₂恒溫培養箱中，種植后24～72小時換成細胞維持液，之后每隔兩天用細胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1／2。?

2.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述漂洗液，經過如下步驟得到：2g海藻糖、3g葡萄糖和10mL雙抗溶于100mL?D-Hank′s液中，混勻，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4～6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol／L，γ射線消毒滅菌，分裝，4℃保存備用。?

3.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述消化液，經過如下步驟得：1.0g胰蛋白酶和0.1g?EDTA溶于100mL?D-Hank′s液中，混勻，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.22μm濾膜過濾除菌，0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4～6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol／L，γ射線消毒滅菌，分裝，4℃保存備用。?

4.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述細胞種植液，經過如下步驟得到：DMEM／F12培養基加入胎牛血清、活性發酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10％、活性發酵濾液終濃度為0.2％，雙抗終濃度為1％，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝，4℃保存備用。?

5.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述細胞維持液，經過如下步驟得到：Neurobasal培養基加入B₂₇和谷氨酰胺，使B₂₇終濃度為2％，谷氨酰胺終濃度1％，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝，4℃保存備用。?

6.根據權利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述D-Hank′s液經過如下步驟得到：NaCl8.0g，KC10.4g，Na₂HPO₄·12H₂O0.12g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g；依次將各成分溶解于約500mL三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL，調整pH值至7.2～7.4，分裝，高壓滅?菌，分裝，4℃保存備用。?

7.根據權利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述雙抗是青霉素-鏈霉素溶液(100×)：青霉素含量為10000U／mL，鏈霉素含量為10mg/mL。

8.根據權利要求4所述的細胞種植液，其特征在于所述活性發酵濾液經過如下步驟得到：?

①長雙歧桿菌(Bifidobacterium?longum)LJM002，該菌株已于2011年05月25日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.4900；?

②長雙歧桿菌LJM002采用改良MRS培養基培養，培養基配方為：以重量計，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，K₂HPO₄2g，MgSO₄·7H₂O0.5g，MnSO₄·4H₂O0.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫-801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115℃高壓滅菌15-20分鐘。?

③將長雙歧桿菌LJM002接種于冷卻至40±2℃的步驟②改良MRS培養基中，菌種接種量為0.2～0.5％，35±2℃厭氧培養24小時，用分光光度計測定上述培養液A_580nm值為1.2時，將上述培養液在轉數5000～8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22μm濾膜過濾除菌，即得到活性發酵液濾液，4℃保存備用。?