[發(fā)明專利]一種生物素標記的川芎嗪及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410066481.6
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103936758A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設計）人: 呂斌;張奕華;劉永章;艾勇
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學
• 主分類號: C07D495/04
• 分類號: C07D495/04;A61K31/497;A61K47/48;A61P39/06;A61P43/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向結(jié)合線粒體DNA上TFAM的化合物及維持線粒體功能穩(wěn)定的應用。

背景技術(shù)

生物素(biotin，B)又稱維生素H、輔酶R，是水溶性維生素，也屬于維生素B族，分子量為244.31，基本結(jié)構(gòu)為雙環(huán)結(jié)構(gòu)：I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的部位；II為噻吩環(huán)，含一個戊酸側(cè)鏈，其末端羧基可與生物大分子連接，形成生物素標記抗原、抗體、酶等。其化學結(jié)構(gòu)中有咪唑酮環(huán)，可與親和素(avidin，AV)和鏈酶親和素(streptavidin，SA)特異性結(jié)合。生物素與親和素之間結(jié)合的親和力高、特異性強，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應時具有的多級放大作用等優(yōu)越性，其相關(guān)技術(shù)被廣泛應用在各種標記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻。

川芎嗪(Ligustrazine)是中藥川芎中含有的一種有效成分，具有抗血小板聚集的作用，并有擴張血管、增加冠脈血流量、改善微循環(huán)及增加腦血流量作用。臨床適用于治療缺血性心臟血管疾病，如冠心病、腦供血不足、腦血栓形成等。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial?transcription?factor?A，TFAM)在維持線粒體功能穩(wěn)定方面有著重要的作用。TFAM是由核DNA編碼的25kD蛋白，TFAM蛋白包含了兩個短串聯(lián)的高遷移率族蛋白(high-mobility?group，HMG)盒域(box?domains)，兩者之間以27個氨基酸殘基連接，其后是一個25個殘基的C末端尾巴。

TFAM是線粒體DNA的結(jié)合蛋白，在線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄、復制和維護上處于中心地位，它在線粒體呼吸鏈氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的過程中也是必不可少的。具體的說是TFAM通過結(jié)合在線粒體DNA輕鏈和重鏈啟動子的上游來促進線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄。線粒體啟動子的起始由TFAM的量調(diào)節(jié)，所以TFAM可影響基因的表達和線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄起始。越來越多的證據(jù)表明，TFAM在維護線粒體DNA穩(wěn)定和調(diào)節(jié)它的拷貝數(shù)上發(fā)揮著重要的作用，大部分TFAM蛋白可維護線粒體DNA的高級結(jié)構(gòu)。線粒體DNA的拷貝數(shù)與TFAM蛋白的量緊密相關(guān)，這也進一步表明，TFAM蛋白和線粒體DNA之間的相互關(guān)系是動態(tài)的，一種組分的存在會增加另一組分的穩(wěn)定性，從調(diào)節(jié)上來說，這種相互作用或許是有益的，因為TFAM蛋白或線粒體DNA水平的微小改變可使二者快速調(diào)節(jié)到最佳比率。研究表明，只需單獨增加TFAM蛋白的表達就足以增加線粒體DNA的水平，可導致線粒體DNA編碼多肽的增加和呼吸鏈穩(wěn)定。

ATP依賴的Lon蛋白酶是一種具有多種功能的酶，其分子量約為100kDa，它在進化過程中非常保守，從archaea(古生菌)到哺乳動物的線粒體都有Lon的類似物，這表明Lon對于維持線粒體體內(nèi)平衡極為關(guān)鍵。Lon具有蛋白酶的功能，介導異常或損傷的蛋白和短暫調(diào)控蛋白的降解來維持細胞體內(nèi)平衡，在蛋白質(zhì)量控制和代謝調(diào)控中起著重要作用。哺乳動物Lon蛋白酶的內(nèi)源性底物為TFAM，此外還包括氧化的線粒體順烏頭酸酶、類固醇合成快速調(diào)控蛋白(StAR)以及細胞色素C氧化酶(COX)等。

因此，迫切需要一種靶向結(jié)合在線粒體DNA上TFAM卻不被Lon蛋白酶降解的化合物，進而維持線粒體的功能穩(wěn)定，而且能夠達到靶向監(jiān)測治療。但到目前為止，還沒有關(guān)靶向線粒體DNA上的TFAM卻不被Lon蛋白酶降解的物質(zhì)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供了靶向性結(jié)合線粒體DNA上的TFAM，卻不被Lon蛋白酶降解的生物素標記的川芎嗪，具有維持線粒體的功能穩(wěn)定，而且能夠達到靶向監(jiān)測治療的作用。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：生物素標記的川芎嗪及其制備方法。

具體的結(jié)構(gòu)式為：

生物素標記的川芎嗪的制備：首先將川芎嗪氧化成2-羥基-3，5，6-三甲基吡嗪，與D-生物素、EDCI，和DMAP按照12∶29∶30∶1的質(zhì)量比溶解于無水DMF中，60℃條件下攪拌反應72h，TLC監(jiān)測反應完全，將反應液倒入到30mL的乙醚中，4℃攪拌4h，析出白色沉淀，過濾，乙醚洗滌，粗品經(jīng)柱層析純化后得生物素標記的川芎嗪，產(chǎn)率為78％左右。

(1)2-羥基-3，5，6-三甲基吡嗪的合成，即中間體