[發明專利]H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒二重RT-PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410066408.9
• 申請日: 2014-02-26
• 公開（公告）號: CN103789454A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 謝芝勛;趙虹;謝麗基;劉加波;范晴;龐耀珊;羅思思;鄧顯文;謝志勤
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于RT-PCR檢測技術領域，尤其涉及一種H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒二重RT-PCR檢測試劑盒。

背景技術

鴨坦布蘇病毒（TMUV）首先發現于2010年中國福建、浙江、江蘇等東部沿海地區，并逐漸蔓延至全國大部分地區。鴨坦布蘇病毒感染鴨后可導致蛋鴨產蛋量嚴重下降，產蛋率可從90％降至10％以內，甚至絕產；感染雛鴨后可導致雛鴨出現站立不穩、倒地不起等神經癥狀，進而導致雛鴨淘汰率升高，嚴重地高達80%，給養鴨業帶來了極大的經濟損失。禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒屬中不同亞型病毒引起的禽類感染和疾病的總稱。H9亞型禽流感病毒（H9AIV）一般呈低至中等毒力，但它分布廣泛、能造成鴨的免疫抑制進而引發與其它鴨病的混合感染，產蛋鴨感染后也可引起產蛋率的明顯下降，極大影響了蛋鴨的經濟效益，因此它對養鴨業的危害也不可忽視。

由于H9亞型禽流感病毒引起鴨的咳嗽、呼吸困難、產蛋量下降等癥狀與鴨副粘病、減蛋綜合癥等疾病引發的癥狀較為相似，在臨床上較難區分，而鴨坦布蘇病毒也存在病毒活力低、滴度下降快等臨床上較難檢測的問題，因此迫切需要建立一種快速敏感的H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒的檢測方法，在感染早期就能檢測出這些病毒，從而為這些病的控制爭取寶貴時間。

目前，這兩種病毒的傳統檢測方法有血清中和試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等，但這些檢測存在耗時長、敏感性較低、不易標準化等缺點，在實際應用中具有一定的局限性。

PCR技術實現了對模板的定量檢測，而且具有敏感、特異、準確可靠、能實現多重反應等特點。在實際應用中，當樣品量非常大時，單重PCR在成本和時間方面就存在一定的劣勢，迫切需要一種高通量、低成本、高效率的方法來進行批量的快速檢測。多重PCR采用多對引物擴增檢測多個模板，克服了單重PCR的不足。然而，建立二重PCR方法比單重要復雜得多，其對試劑和引物的要求更高，同時需要保證不同引物間無相互干擾。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種操作簡便、敏感性高、特異性強、重復性好的H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，以實現同時檢測和鑒別H9亞型禽流感病毒與鴨坦布蘇病毒兩種病原體。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒二重RT-PCR檢測引物組，包括兩對特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為0.5-1∶0.5-1∶1∶1。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1∶1∶1∶1。

上述H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒二重RT-PCR檢測引物組在二重PCR擴增方面的應用，二重PCR擴增的退火溫度為50.0-60.1℃。

二重PCR擴增的退火溫度為54.5℃。

H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有以下試劑：

A液：PCR反應液，含2×Taq?PCR?Mix(購自全式金.AS111-12)、H9AIV上下游引物、TMUV上下游引物、ddH₂O，H9AIV上下游引物分別是引物1和2，TMUV上下游引物分別是引物3和4，引物1至4分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列；

B液：H9AIV+TMUV模板，作為陽性對照；

C液：ddH₂O，作為陰性對照。

PCR反應液含2×Taq?PCR?Mix25μL、H9AIV上下游引物各0.8μl、TMUV上下游引物各1.2μl、ddH₂O1.0μL，其中各引物濃度均為50μmol/mL；B液含H9AIV+TMUV模板各10μL，C液為2μL?ddH₂O。

上述H9亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒二重RT-PCR檢測試劑盒在二重PCR擴增方面的應用，二重PCR擴增的退火溫度為50.0-60.1℃。

二重PCR擴增的退火溫度為54.5℃。