[發明專利]H10亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410066340.4
• 申請日: 2014-02-26
• 公開（公告）號: CN103820577A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 謝芝勛;羅思思;劉加波;龐耀珊;鄧顯文;謝志勤;謝麗基;范晴
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及H10亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。

背景技術

禽流感（Avian?Influenza,AI）是禽流行性感冒的簡稱，是由正粘病毒科流感病毒屬A型禽流感流行性感冒病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）傳染病。根據A型流感病毒表面糖蛋白（Hemagglutinin,HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗原性不同，禽流感病毒（AIV）可進一步分為不同的亞型，目前已發現有16種HA亞型和9種NA亞型。AIV是一種有包膜、單股負鏈、分節段的RNA病毒，病毒基因組由8個分節段負鏈RNA組成。AIV基因組的分節段特性使得兩種或兩種以上不同亞型流感病毒共同感染一個細胞時，子代病毒在裝配時其核酸片段可能以同源交換的形式發生基因重排而導致抗原轉變，從而產生能引起大流行的新流行株。H10亞型AIV為稀有亞型AIV，對該病的研究相對較少，但該H10亞型AIV近期引起了廣泛的關注。2013年12月6日，江西省南昌市一名73歲女子罹患H10N8甲型禽流感，因呼吸衰竭、休克死亡，這是全球首例人類感染H10N8的死亡案例。2014年1月25日，也是在南昌，又確診一例H10N8亞型禽流感。目前，國內外尚未見有該H10亞型AIV的檢測方法，因此，建立一種快速、簡便和特異的檢測試劑盒十分迫切，對該病的診斷具有重要意義。

目前禽流感病毒常采用的檢測方法包括病毒雞胚分離、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光技術（IFA）、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene?chips)。傳統的病毒雞胚分離方法準確、簡便，但耗時太長，通常需要兩天到一周的時間；IFA、ELISA快速但需要特殊試劑；RT-PCR、RRT-PCR、Gene?chips檢測技術快速、靈敏，但都需要特殊儀器和技術人員，且成本較高，不適合在基層推廣使用。

環介導等溫擴增技術（loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP）是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst?DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環的鏈置換核酸擴增反應，整個反應不需要特殊的儀器設備，僅在水浴鍋中就可完成。LAMP技術在目的基因保守區設計了針對8個特異區域的6條引物，使擴增反應具有很高的特異性。LAMP反應結果的觀察方法非常簡便，通過濁度儀實時監測擴增過程，可通過電腦觀察擴增曲線，不需等到試驗全部結束，即可判定結果，反應結束后可通過觀察反應液的顏色變化，肉眼直接判定結果，對檢測結果進一步的驗證，如無濁度儀，可用水浴鍋代替濁度儀進行反應。由于LAMP反應的擴增效率很高，在少量cDNA存在的條件下就可進行核酸的大量擴增，所以只需要在LAMP反應體系中加入反轉錄酶，通過逆轉錄環介導等溫擴增反應（RT-LAMP）就可以完成RNA的檢測。RT-LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優勢，只需等溫條件下就可反應，尤其適合在基層開展RT-LAMP試劑盒的應用推廣。RT-LAMP技術中，引物是決定檢測結果靈敏度和特異性的關鍵因素。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測H10亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增引物組。

本發明所提供的檢測H10亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增引物組，為如下引物組A或引物組B：

所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；

所述引物1（內引物FIP-H10）、所述引物2（內引物BIP-H10）、所述引物3（外引物F3-H10）、所述引物4（外引物B3-H10）、所述引物5（環引物LF-H10）和所述引物6（環引物LB-H10）的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

所述引物組A中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比具體可為8：8：1：1：4：4；所述引物組B中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體可為8：8：1：1。