[發(fā)明專利]一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410064966.1
• 申請(qǐng)日: 2014-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN103849687A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧其福;陳士林;黃喜梅;李西文;劉薇;黃林芳;高麗;周立
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州白云山潘高壽藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于中藥鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法。

背景技術(shù)

太白貝母，又稱太貝、尖貝、秦貝，為百合科Liliaceae貝母屬Fritillaria?L.植物太白貝母F.taipaiensis?P.Y.Li的干燥鱗莖，主治肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、咯痰帶血，為2010版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄品種。太白貝母和瓦布貝母在藥典中均作為川貝母入藥，加之川貝母、梭砂貝母、甘肅貝母和暗紫貝母，川貝母基源植物達(dá)到6個(gè)，但其外形極為相似，僅有微小變異，傳統(tǒng)經(jīng)典分類學(xué)主要依據(jù)花特征進(jìn)行鑒定，但由于花器官特征性差別小及過(guò)渡類型較多，定性非定量的方法難以客觀的進(jìn)行區(qū)分。以川貝母入藥的源植物與貝母屬其它常見藥典載品種同樣難以區(qū)分，如平貝母、浙貝母和伊犁貝母等。生物條形碼對(duì)物種的鑒定科學(xué)、快速、有效，易于形成標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)貝母屬藥用植物的鑒別具有重要意義。

葉綠體基因作為DNA?Barcoding標(biāo)準(zhǔn)序列的地位已經(jīng)得到公認(rèn)，但是在DNA條形碼鑒定研究工作中發(fā)現(xiàn)，盡管該方法具有操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)、適用于多個(gè)分類階元等諸多優(yōu)點(diǎn)，但DNA條形碼長(zhǎng)度多介于300-700bp之間，有時(shí)包含序列的變異信息不充足，在區(qū)分和鑒定部分藥用植物（如貝母屬）種內(nèi)和種間樣品時(shí)存在困難；同時(shí)植物基因組的高變異性導(dǎo)致在植物中至今還未找到公認(rèn)的通用DNA條形碼序列，以上從理論上證明一些常用的DNA條形碼在通用性上存在局限性。葉綠體基因組在植物中廣泛存在，長(zhǎng)度達(dá)到120-160kb，與DNA條形碼相比，具有更好的通用性和更強(qiáng)的分辨力。但是由于測(cè)序模板提取還存在一定的困難，在沒有近緣物種的序列時(shí)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝仍然是復(fù)雜的。因此，現(xiàn)有技術(shù)中認(rèn)為采用葉綠體基因組進(jìn)行物種的鑒定目前還不是一個(gè)好的選擇。本發(fā)明通過(guò)對(duì)太白貝母葉綠體基因組的獲得及同屬近緣物種的分析，首次提出可以利用葉綠體全基因組對(duì)太白貝母進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是以葉綠體基因組全序列作為太白貝母的分子鑒定標(biāo)記，對(duì)太白貝母進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒定。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，該方法包括提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化，進(jìn)行測(cè)序與序列拼接，得到完整的葉綠體基因組序列，將該序列與太白貝母的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，得到分析鑒定結(jié)果，其中，太白貝母葉綠體基因組序列的NCBI序列號(hào)為KC543997。

上述方法中，所述提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化的具體方法為：

（1）取新鮮幼嫩葉片，4℃暗處理24h，洗凈，去葉脈，撕成碎片，加4℃預(yù)冷的緩沖液A置于勻漿器中，充分勻漿，然后過(guò)濾，收集濾液，棄渣；

（2）將濾液，于4℃，1500g，離心15min，棄上清；

（3）用緩沖液1清洗沉淀；

（4）用洗滌緩沖液懸浮沉淀，在一個(gè)新的離心管中加入30%的蔗糖溶液，將沉淀懸浮液覆蓋在30%的蔗糖溶液的表面，于4℃，2500g，離心15min，沉淀葉綠體；

（5）沉淀重懸于洗滌緩沖液中，于4℃，100g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到新管并在380g離心10min；

（6）沉淀重懸于洗滌緩沖液中，將該溶液覆蓋于蔗糖梯度的頂部，于4℃，20000g離心70min；其中，蔗糖梯度由7mL30%和16.5～18mL52%的蔗糖溶液組成；

（7）去掉上層，從52%和30%的蔗糖溶液的中間相，將葉綠體DNA收集到離心管中，然后加入洗滌緩沖液，于4℃，1500g離心15min沉淀葉綠體DNA；

（8）用緩沖液2清洗沉淀，于4℃，1500g，離心15min，取沉淀,加入緩沖液2和濃度為10mg/mL的蛋白酶K，室溫靜置2min，加入1/5體積的裂解液，顛倒混勻，然后在50℃保溫至少1h，冰上冷卻；

（9）轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min；其中，酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1；

（10）上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2/5體積的5mol·L^-1NaCl，2/5體積的預(yù)熱至65℃的CTAB/NaCl，并68℃加熱15分鐘，加入等體積的氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min，取上清；其中，氯仿:異戊醇的體積比為24:1；

（11）重復(fù)（10）