[發(fā)明專利]一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410064966.1
• 申請(qǐng)日: 2014-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN103849687A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧其福;陳士林;黃喜梅;李西文;劉薇;黃林芳;高麗;周立
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州白云山潘高壽藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

1.一種太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，該方法包括提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化，進(jìn)行測(cè)序與序列拼接，得到完整的葉綠體基因組序列，將該序列與太白貝母的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，得到分析鑒定結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，太白貝母葉綠體基因組序列的NCBI序列號(hào)為KC543997。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，提取待鑒定藥材的葉綠體基因組DNA并純化的具體方法為：

（1）取新鮮幼嫩葉片，4℃暗處理24h，洗凈，去葉脈，撕成碎片，加4℃預(yù)冷的緩沖液A置于勻漿器中，充分勻漿，然后過(guò)濾，收集濾液，棄渣；

（2）將濾液，于4℃，1500g，離心15min，棄上清；

（3）用緩沖液1清洗沉淀；

（4）用洗滌緩沖液懸浮沉淀，在一個(gè)新的離心管中加入30%的蔗糖溶液，將沉淀懸浮液覆蓋在30%的蔗糖溶液的表面，于4℃，2500g，離心15min，沉淀葉綠體；

（5）沉淀重懸于洗滌緩沖液中，于4℃，100g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到新管并在380g離心10min；

（6）沉淀重懸于洗滌緩沖液中，將該溶液覆蓋于蔗糖梯度的頂部，于4℃，20000g離心70min；其中，蔗糖梯度由7mL30%和16.5～18mL52%的蔗糖溶液組成；

（7）去掉上層，從52%和30%的蔗糖溶液的中間相，將葉綠體DNA收集到離心管中，然后加入洗滌緩沖液，于4℃，1500g離心15min沉淀葉綠體DNA；

（8）用緩沖液2清洗沉淀，于4℃，1500g，離心15min，取沉淀,加入緩沖液2和濃度為10mg/mL的蛋白酶K，室溫靜置2min，加入1/5體積的裂解液，顛倒混勻，然后在50℃保溫至少1h，冰上冷卻；

（9）轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min；其中，酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1；

（10）上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2/5體積的5mol·L^-1NaCl，2/5體積的預(yù)熱至65℃的CTAB/NaCl，并68℃加熱15分鐘，加入等體積的氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min，取上清；其中，氯仿:異戊醇的體積比為24:1；

（11）重復(fù)（10）

（12）加等體積的氯仿:異戊醇，顛倒混勻，靜置5min，2600g室溫離心20min；其中，氯仿:異戊醇的體積比為24:1；

（13）取上清，加入0.1倍體積的3mol·L^-1NaAc和0.8倍體積的預(yù)冷異丙醇或是加入0.1倍體積的3mol·L^-1NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置至少20min沉淀葉綠體DNA；

（14）4℃，13500g離心20min，將沉淀用70%的乙醇室溫清洗兩次，13500g離心10min，風(fēng)干，用含有RNA酶的TE重懸，37℃保溫1h，得到葉綠體DNA；

其中，所述緩沖液A含有50mM?Tris，25mM?EDTA，1.25M?NaCl，0.25M抗壞血酸，1%PVP40，0.1%BSA，1mM?DTT，pH3.6；

所述緩沖液1含有1.25M?NaCl，pH8.0的50mM?Tris-HCl，pH8.0的7mMEDTA，5%PVP40，0.1%BSA，1mM?DTT；

所述洗滌緩沖液含有0.35M山梨醇，pH8.0的50mM?Tris-HCl，pH8.0的25mM?EDTA；

所述緩沖液2含有pH8.0的10mM?Tris-HCl，pH8.0的5mM?EDTA；

所述裂解液含有20%十二烷基肌氨酸鈉，pH8.0的50mM?Tris-HCl，pH8.0的25mM?EDTA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，葉綠體基因組DNA測(cè)序與序列拼接是采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的太白貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于，所述第二代高通量測(cè)序技術(shù)是通過(guò)Roche454GS?FLX高通量測(cè)序儀完成。