[發明專利]基于納米磁珠的核酸提取純化方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201410062784.0
• 申請日: 2014-02-25
• 公開（公告）號: CN103820431A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 李明;李紅東;苗保剛;彭年才;倪曉龍;李政
• 申請（專利權）人: 蘇州天隆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 蘇州慧通知識產權代理事務所(普通合伙) 32239
• 代理人: 安紀平

技術領域

本發明涉及磁珠法提取純化核酸領域，尤其是涉及一種基于納米磁珠的核酸提取純化方法及試劑盒。

背景技術

核酸包括脫氧核糖核酸(RNA)和核糖核酸(DNA)兩類，己知核酸是一切生物體的遺傳物質，在細胞主要存在于細胞核內，在病毒存在于病毒衣殼內。目前，在生物醫學的各個領域都離不開核酸的提取和純化，應用生物納米材料，快速、高通量分離純化得到高純度完整的目的核酸DNA/RNA是生物學科的基礎。

正因為如此，核酸提取方法多種多樣，如酚/氯仿等有機溶劑抽提法、螯合樹脂法、玻璃粉吸附法，當前主流的硅膠膜吸附柱法都因為有機溶劑對人體的傷害、操作繁瑣或提取的核酸DNA/RNA濃度純度低、實現自動化困難、單位時間通量低等諸多原因而成為生物學高速發展的瓶頸。

納米磁珠法在外加磁力的作用下，可快速分離純化核酸DNA/RNA，因安全并易于實現自動化而迅速發展。納米磁珠核酸提取方法是指以超順磁性氧化硅納米磁性微球(以下簡稱磁珠)為載體，通過磁珠在高鹽、低PH溶液中吸附核酸，而在低鹽溶液中將核酸從磁珠表面脫離的原理進行核酸提取的方法，通常使用的納米級磁珠的直徑在100nm～800nm之間。由于磁珠的以下特點，使得磁珠法核酸提取方法非常適用于自動化應用。

納米磁珠是由四氧化三鐵或三氧化二鐵等磁性微球與各種含活性功能基團的二氧化硅等材料復合而成的具有一定磁性及特殊表面結構的球形微粒。通過聚合作用給磁性微球表面增添不同功能基團如-COOH、-OH等，也可共價結合酶、細胞、抗體等生物活性物質，磁珠便被賦予了多種活性功能，即形成多種性質磁珠。對比普通顆粒材料，球形磁珠具有很好的表面體積效應比，選擇性吸附能力大，吸附平衡時間短。四氧化三鐵或三氧化二鐵晶體的粒徑小于一定值時，磁珠便具有了很好的瞬時磁響應性，也就是我們常說的超順磁性，即可避免發生中粒子那樣的磁性團聚；因為具有超順磁性，磁珠可在外加磁場的作用下地被定位、導向和分離。

現有的磁珠提取法需要依賴于蛋白酶K，且提取步驟較復雜，所以所需的提取時間就會相對較長，另外提取出的樣品也存在純度不太高的問題，因此提純后的樣品不能完全滿足后續的實驗要求。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種基于納米磁珠的核酸提取純化方法及試劑盒，以實現快速、高通量、自動化地提取純化核酸DNA/RNA。

為實現上述目的，本發明提出如下技術方案：基于納米磁珠的核酸提取純化方法，包括以下步驟：

1)在生物樣品中加入裂解緩沖液，使樣品中細胞、細胞核破裂，核酸DNA/RNA與核蛋白分離，核蛋白變形沉淀，裂解分離出所述生物樣品中的核酸DNA/RNA，所述核酸DNA/RNA與所述裂解緩沖液中的納米磁珠結合，在外部磁場作用下，納米磁珠聚集，形成磁珠-核酸復合物；

2)向所述磁珠-核酸復合物中加入洗滌緩沖液，洗滌去除磁珠-核酸復合物上的雜質，在外部磁場作用下，納米磁珠聚集，收集洗滌后的磁珠-核酸復合物；

3)向所述洗滌后的磁珠-核酸復合物中加入洗脫緩沖液，將結合在納米磁珠上的核酸DNA/RNA洗脫下來回收，即得到純化的核酸DNA/RNA。

優選地，所述裂解緩沖液包括：碘化鈉1.5～3M，鹽酸胍2～3M，EDTA1～10mM，Tween-203％，納米磁珠8％，SDS2％，異丙醇35％，所述裂解緩沖液的PH值＝7.4；

所述洗滌緩沖液包括：EDTA1～10mM，Tris-cl150mM，乙醇75％，所述洗滌緩沖液的PH值＝6.4；

所述洗脫緩沖液采用1mM氫氧化鈉液。

所述生物樣品包括有細胞液體樣品和無細胞液體樣品，所述有細胞液體樣品包括細胞、全血、動物組織勻漿液，所述無細胞液體樣品包括血清、血漿、組織提取液、拭子洗液、尿液、病毒培養液。

所述納米磁珠為超順磁性氧化硅納米磁性微珠，直徑為100～800nm，具有核殼結構，即超順磁性核心及氧化硅外殼。

本發明還提供了一種基于納米磁珠的核酸提取純化試劑盒，所述試劑盒中的組分包括裂解緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，所述裂解緩沖液包括：碘化鈉1.5～3M，鹽酸胍2～3M，EDTA1～10mM，Tween-203％，納米磁珠8％，SDS2％，異丙醇35％，所述裂解緩沖液的PH值＝7.4，所述異丙醇增強了裂解緩沖液中高濃度鹽(主要是鹽酸胍、碘化鈉)主導的納米磁珠吸附核酸的作用，鹽酸胍、碘化鈉不但有促進納米磁珠和核酸結合的作用，還有解離核酸DNA/RNA和核蛋白的作用。