[發(fā)明專利]工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410062069.7
• 申請日: 2014-02-24
• 公開（公告）號: CN103820393A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓為東;韓慶旺;王瑤;付小兵
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍總醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 劉茵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，涉及過繼免疫治療中的一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞（CAR20-NKT細(xì)胞）、其制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)

臨床將TCR^-、mIg^-、CD56⁺、CD16⁺、CD3⁺淋巴樣細(xì)胞鑒定為NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞表面標(biāo)志，又表達(dá)NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，NKT細(xì)胞能夠識別和殺傷突變的腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，而對正常自身組織細(xì)胞無細(xì)胞毒作用。NKT細(xì)胞通過自身表面的CD16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮ADCC(antibody-dependent?cell-mediated?cytotoxicity)作用。但是，在抗體介導(dǎo)的ADCC作用過程中，抗體能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，NKT細(xì)胞等對靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。通常情況下，輸注的NKT細(xì)胞在患者體內(nèi)半衰期一般為2周左右，有效期短暫，需要反復(fù)多次輸注。另外，NKT細(xì)胞本身缺少非特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤巢中富集，制約了NKT細(xì)胞對進展期惡性腫瘤的靶向治療。

嵌合抗原受體（chimeric?antigen?receptor，CAR）是由抗原識別結(jié)構(gòu)域（配體或單鏈抗體）和胞內(nèi)的一系列信號結(jié)構(gòu)域依次連接而成，具體包括抗原特異性的受體（如單鏈抗體ScFv），間隔序列（spacer），跨膜序列（TM?Domain）和胞內(nèi)共刺激信號分子。在體內(nèi)CAR修飾的淋巴細(xì)胞能夠通過其單鏈抗體特異的識別相關(guān)腫瘤表面抗原，然后通過胞內(nèi)共刺激信號分子將識別的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞的殺傷性，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

CD20單克隆抗體療法在治療B細(xì)胞淋巴瘤中已取得了令人滿意的效果，但是很多患者最終會產(chǎn)生耐藥性。CD20分子是一種B細(xì)胞分化抗原，僅表達(dá)于前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞表面，表達(dá)于95%以上的B細(xì)胞性淋巴瘤，而在造血干細(xì)胞、漿細(xì)胞和其他正常組織細(xì)胞中不表達(dá)。重要的是，CD20分子在膜上比較暴露，容易接近，與單克隆抗體結(jié)合后無顯著內(nèi)化及脫落，也不會因為與抗體的結(jié)合而發(fā)生抗原調(diào)變，故成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞及其制備方法，本發(fā)明的另一個目的是提供工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤制劑中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，該細(xì)胞是嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞，該嵌合抗原受體由CD20ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。

如上所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的核苷酸序列如序列表中SEQID?NO.2所示。

一種如上所述NKT細(xì)胞的制備方法，該方法包括以下步驟：通過RT-PCR從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，以及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，酶切、膠回收后通過T4DNA連接酶連接到載體pWPT-GFP，構(gòu)建得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ；再通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長激素信號肽和CD20ScFv的核苷酸序列，酶切、膠回收后克隆到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ，測序驗證序列正確性，得到pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ；然后包裝成攜帶pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ編碼基因的慢病毒；利用該慢病毒感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。

一種如上所述NKT細(xì)胞的制備方法，優(yōu)選地，該方法包括以下步驟：

1）NKT細(xì)胞的制備：分離靜脈血中的單個核細(xì)胞，進行培養(yǎng)獲得NKT細(xì)胞；