[發(fā)明專利]工程化CD20靶向性的NKT細胞及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410062069.7
• 申請日: 2014-02-24
• 公開（公告）號: CN103820393A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓為東;韓慶旺;王瑤;付小兵
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍總醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 劉茵

1.一種工程化CD20靶向性的NKT細胞，其特征在于，該細胞是嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細胞，該嵌合抗原受體由CD20ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。

2.如權(quán)利要求1所述的工程化CD20靶向性的NKT細胞，其特征在于，所述嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的核苷酸序列如序列表中SEQID?NO.2所示。

3.一種如權(quán)利要求1所述NKT細胞的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：通過RT-PCR從NKT細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，以及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，酶切、膠回收后通過T4DNA連接酶連接到載體pWPT-GFP，構(gòu)建得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ；再通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長激素信號肽和CD20ScFv的核苷酸序列，酶切、膠回收后克隆到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ，測序驗證序列正確性，得到pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ；然后包裝成攜帶pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ編碼基因的慢病毒；利用該慢病毒感染NKT細胞，使NKT細胞表達該嵌合抗原受體。

4.一種如權(quán)利要求3所述NKT細胞的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

1）NKT細胞的制備：分離靜脈血中的單個核細胞，進行培養(yǎng)獲得NKT細胞；

2）重組質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的構(gòu)建：以提取步驟1培養(yǎng)后NKT細胞cDNA為模板，利用引物P1、P2進行PCR擴增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如序列表中SEQID?NO.3所示，兩端分別含有MluI和BglⅡ酶切位點和保護堿基；利用引物P3、P4進行PCR擴增獲得基因CD137胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID?NO.4所示，兩端分別含有BglⅡ和EcoRI酶切位點及保護堿基；利用引物P5、P6進行PCR擴增基因CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID?NO.5所示，兩端分別含有EcoRI和SalI酶切位點及保護堿基，將獲得的PCR產(chǎn)物電泳分離純化后分別進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后與MluI/SalI雙酶切后的慢病毒表達載體pWPT-GFP通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans1-T1Phage?Resistant化學感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-CD8-CD137-CD3ζ；

3）嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的構(gòu)建：將含有大鼠生長激素信號肽和CD20ScFv的質(zhì)粒pGSI-CD20ScFv進行BglⅡ/MluI雙酶切，回收DNA片段；其中，該大鼠生長激素信號肽核苷酸序列如序列表中SEQID?NO.6，5’端含有BglⅡ、kozak序列，該CD20ScFv核苷酸序列如序列表中SEQID?NO.7，其3’端含有MluI酶切位點；將步驟2回收的重組質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ進行BamHI/MluI雙酶切，回收載體片段；將酶切后的DNA片段和質(zhì)粒載體片段連接后轉(zhuǎn)入Trans1-T1Phage?Resistant化學感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞大量擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒即為嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ；

4）嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾NKT細胞：慢病毒表達質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ與輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G按4:2:1的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293T包裝細胞，轉(zhuǎn)染48h、72h時收集病毒上清，離心并用4.5μm濾器過濾，在濾液中添加1/4體積的5×PEG6000-NaCl進行混勻，離心后棄上清，沉淀用4℃預(yù)冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液；

5）嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾NKT細胞：取1×10⁷-5×10⁷NKT細胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2-4mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，加入200-400μL步驟4）得到的病毒濃縮液、2-4μL1×10^-6單位魚精蛋白、終濃度為1000U/mL?IL-2，置于37℃，5%CO₂孵箱中感染12-16小時后，棄培養(yǎng)液，將細胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培養(yǎng)基，于37℃，5%CO₂孵箱繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)8-15天后，感染獲得嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細胞，該嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID?NO.1所示。