[發明專利]辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法

有效

• 申請號: 201410060630.8
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103884765A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 呂曉菡;柴偉國;方獻平
• 申請（專利權）人: 杭州市農業科學研究院
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/28
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及一種辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法。

背景技術

辣椒（Chili?Pepper）原產于中拉丁美洲熱帶地區，原產國是墨西哥。為一年生或多年生植物，其Vc的含量在蔬菜中居第一位，具有較高的營養價值。辣椒為常異花授粉植物，雜交優勢顯著。但在雜交繁種中，由于母本去雄費時費工，且雜交種子純度難以保證。而利用CMS三系配套法生產雜交種子，不但可減少人工去雄的麻煩，降低制種成本，而且能保障雜交種子的純度。目前,國內外已選育出多個辣椒胞質雄性不育系，并逐步應用于辣椒雜交種子的生產。因此，利用CMS三系配套法生產雜交種子在辣椒生產上具有極大的潛力和市場需求。但是通過自然變異獲得不育系的概率比較小，且數量少。另外，如果引進不育系，其需要穩定的時間周期又比較長。因此，穩定不育系的難獲得，已成為目前辣椒利用CMS三系配套法雜交制種的最大障礙。利用基于雙向電泳的蛋白質組學技術，可以快速挖掘出辣椒育性不同的差異基因表達的產物，從而闡述不育機制，為將來辣椒雜交制種工作提供重要技術支撐。

現有研究辣椒不育機理的方法往往借助于基因組學技術，可以在一定程度上挖掘植物不育的重要基因。但是因為蛋白質是基因表達的最終產物，所以找出與不育相關的直接差異蛋白將更有助于不育機理的研究。利用基于雙向電泳的差異蛋白質組學技術，獲得高質量的差異蛋白圖譜，是研究不育機理的強有力工具。目前利用雙向電泳獲得蛋白圖譜的方法在生物醫學領域和部分植物研究（如蘋果葉片）等植物種類有一定程度的應用，但是在辣椒，特別是花藥研究方面幾乎空白。張彩霞等借助酚抽提法在蘋果葉片中得到了高質量的蛋白質點圖譜。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種能得到高質量辣椒花藥雙向電泳蛋白質圖譜的獲取方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法，包括以下步驟：

1）、利用辣椒花藥進行蛋白質的提取；

2）、第一向IPG等電聚焦(IEF)電泳：

取步驟1）所得的蛋白提取液40μL、240～280μL的IPG?buffer混勻后配成水化溶液，裝入等電聚焦槽中；利用等電聚焦膠條進行等電聚焦；設定參數如下：

IPG?buffer的制備方法為：在每ml水中加入380mg尿素、15mg的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽、5.5mg二硫蘇糖醇、10μL載體兩性電解質Ampholine?pH3-10；

3）、膠條的平衡：

①、配制平衡緩沖液：

在1L的Tris-Hcl緩沖液（0.45mol/L，pH8.8）中加入6mol的尿素，150ml的甘油，25g的十二烷基硫酸鈉(SDS)；得平衡緩沖液；

②、在10ml平衡緩沖液中加入80mg二硫蘇糖醇均勻混合后，將步驟2）的等電聚焦完成后的膠條置于上述含二硫蘇糖醇的平衡緩沖液中振蕩（為輕微振蕩，振蕩頻率為60～100rpm）平衡20min；

③、在10ml平衡緩沖液中加入200mg碘乙酰胺均勻混合后，將步驟②所得的膠條放入上述含碘乙酰胺的平衡緩沖液中，再振蕩（為輕微振蕩，振蕩頻率為60～100rpm）平衡20min；

④、將步驟③所得的膠條用去離子水沖洗，干燥（即，將膠條邊緣置于濾紙上1分鐘，吸去多余水分）；

4）、膠條的轉移及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：

①、將步驟3）所得的平衡后的膠條轉移至SDS-PAGE膠，得轉移后膠條；

②、將轉移后膠條用瓊脂糖封頂液進行封閉；所述瓊脂糖封頂液的制備方法為：在濃度為0.01g/mL的瓊脂糖溶液5ml中加入0.2mg的溴酚藍；

然后在第二向電泳槽的上下槽中分別加入電泳緩沖液，進行第二向電泳(恒流30mA，4～5h)；直至溴酚藍前沿抵達膠邊緣處為止；

所述電泳緩沖液的制備方法為：在每L水中加入2g?Tris?base、12.3g甘氨酸和0.8g?SDS。

③、第二向電泳結束后，將凝膠放置于考馬斯亮藍R-250染色液中，振蕩染色10～14小時（例如為過夜，12小時）；倒掉染色液，加入脫色液，繼續在搖床上振蕩脫色，每隔20min換一次脫色液，直至凝膠背景透明；

所述脫色液由35％乙醇、20%乙酸和45％超純水組成，上述%為體積%；

所述考馬斯亮藍R-250染色液的制備方法為：1.0g考馬斯亮藍R-250粉末溶于350ml甲醇、100ml乙酸和550ml超純水中；

5）、凝膠掃描和圖像分析：