[發明專利]辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法

有效

• 申請號: 201410060630.8
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103884765A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 呂曉菡;柴偉國;方獻平
• 申請（專利權）人: 杭州市農業科學研究院
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/28
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法，其特征是包括以下步驟：

1）、利用辣椒花藥進行蛋白質的提取；

2）、第一向IPG等電聚焦電泳：

取步驟1）所得的蛋白提取液40μL、240～280μL的IPG?buffer混勻后配成水化溶液，裝入等電聚焦槽中；利用等電聚焦膠條進行等電聚焦；設定參數如下：

所述IPG?buffer的制備方法為：在每ml水中加入380mg尿素、15mg的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽、5.5mg二硫蘇糖醇、10μL載體兩性電解質Ampholine?pH3-10；

3）、膠條的平衡：

①、配制平衡緩沖液：

在1L的Tris-Hcl緩沖液（0.45mol/L，pH8.8）中加入6mol的尿素，150ml的甘油，25g的十二烷基硫酸鈉，得平衡緩沖液；

②、在10ml平衡緩沖液中加入80mg二硫蘇糖醇均勻混合后，將步驟2）的等電聚焦完成后的膠條置于上述含二硫蘇糖醇的平衡緩沖液中振蕩平衡20min；

③、在10ml平衡緩沖液中加入200mg碘乙酰胺均勻混合后，將步驟②所得的膠條放入上述含碘乙酰胺的平衡緩沖液中，再振蕩平衡20min；

④、將步驟③所得的膠條用去離子水沖洗，干燥；

4）、膠條的轉移及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：

①、將步驟3）所得的平衡后的膠條轉移至SDS-PAGE膠，得轉移后膠條；

②、將轉移后膠條用瓊脂糖封頂液進行封閉；所述瓊脂糖封頂液的制備方法為：在濃度為0.01g/mL的瓊脂糖溶液5ml中加入0.2mg的溴酚藍；

然后在第二向電泳槽的上下槽中分別加入電泳緩沖液，進行第二向電泳（恒流30mA，4～5h）；直至溴酚藍前沿抵達膠邊緣處為止；

所述電泳緩沖液的制備方法為：在每L水中加入2g?Tris?base、12.3g甘氨酸和0.8g?SDS。

③、第二向電泳結束后，將凝膠放置于考馬斯亮藍R-250染色液中，振蕩染色10～14小時；倒掉染色液，加入脫色液，繼續振蕩脫色，每隔20min換一次脫色液，直至凝膠背景透明；

所述脫色液由35％乙醇、20%乙酸和45％超純水組成，上述%為體積%；

所述考馬斯亮藍R-250染色液的制備方法為：1.0g考馬斯亮藍R-250粉末溶于350ml甲醇、100ml乙酸和550ml超純水中；

5）、凝膠掃描和圖像分析：

包括將考馬斯亮藍顯色后的膠片通過BIO-RAD公司的GS-800calibrated?Densitometer電泳掃描分析系統獲取圖像，從而得辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜。

2.根據權利要求1所述的辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法，其特征是：

所述步驟4）中的SDS-PAGE膠的制備方法中所用的凝膠溶液為12%的凝膠溶液；所述12%的凝膠溶液的制備方法為：

在13.4ml的超純水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的混合水溶液、10ml的Tris-Hcl緩沖液（1.5mol/L，pH8.8）、0.4ml的SDS水溶液、200μL的過硫酸銨水溶液、20μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；

每ml丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的混合水溶液含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉雙丙烯酰胺，其余為水；每ml?SDS水溶液中含有100mg的SDS，其余為水；每ml過硫酸銨水溶液中含有100mg的過硫酸銨，其余為水。

3.根據權利要求1或2所述的辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法，其特征是：

所述蛋白質的提取包括以下步驟：

①、取0.4g辣椒花藥用液氮研磨后將其懸浮于10ml的三氯乙酸/丙酮溶液中，-20℃沉淀10小時；

所述三氯乙酸/丙酮溶液由8%的三氯乙酸和92%的丙酮組成，上述%為體積%；

②、將步驟①的所得物離心，棄上清；

③、將步驟②所得的沉淀懸浮于10ml的B-巰基乙醇冷丙酮溶液；離心；

所述B-巰基乙醇冷丙酮溶液的制備方法為：將冷丙酮與B-巰基乙醇按照1：0.09的體積比進行混合；所述冷丙酮為溫度為4℃的丙酮；

④、將步驟③所得的沉淀真空抽干至含水量≤0.05%（質量%），得到粗蛋白干粉；加入lml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，離心，所得的即為蛋白提取液；

所述裂解液A為在每ml水中加入380mg尿素、100mg硫脲、30mg3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽、6.2mg二硫蘇糖醇、10μL載體兩性電解質Ampholine?pH3-10，0.174mg苯甲基磺酰氟制備而得。