[發明專利]基于單鏈抗體的金標試紙的制備方法

有效

• 申請號: 201410059162.2
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103995121A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 胡學軍;曹際娟;趙昕;楊春光
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 任洪成

1.基于單鏈抗體的金標試紙的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、通過中性氨基酸短肽連接的帶正電標簽單鏈抗體基因表達載體構建：

（1）在單鏈抗體基因的5′端通過基因重組引入編碼帶正電短肽標簽,融合基因組成依次由編碼帶正電的短肽、中性短肽和單鏈抗體基因，或者在單鏈抗體基因的3′端通過基因重組引入編碼帶正電短肽標簽,融合基因組成依次由編碼單鏈抗體基因、中性短肽和帶正電的短肽標簽組成，帶正電短肽標簽組成：5-12個精氨酸殘基或者5-12個賴氨酸殘基或者6-12個二者混合氨基酸殘基共同組成的短肽標簽，分別以R5-12、K5-12、（RK）3-6表示，R精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基；中性短肽由8至20個天冬酰胺殘基組成，N8-20,?N代表天冬酰胺殘基，在基因的另一端，通過基因重組引入編碼6個組氨酸殘基堿基序列；

（2）將以上融合基因構建到大腸桿菌質周腔表達載體上，融合的單鏈抗體將在大腸桿菌質周腔中表達；

二、將構建的單鏈抗體基因質周腔表達載體轉化到大腸桿菌工程菌株，將鑒定過的陽性轉化子進行自誘導表達，誘導表達3-6小時，培養基中添加與表達載體所帶抗性基因相應的抗生素；

三、收集菌體，提取質周腔可溶蛋白，用親和層析方法，分離純化攜帶帶正電標簽的單鏈抗體；

四、制備金標單鏈抗體，將0.5毫升的300?納克/毫升單鏈抗體逐滴加到8毫升的膠體金溶液中，輕輕混勻，混合液在室溫反應1小時，然后，用10%的牛血清白蛋白（BSA）封閉30分鐘，混合液在4攝氏度，以每分鐘14000轉離心30分鐘，棄掉上清液，金顆粒沉淀用450微升1%的20?毫摩爾pH8.0的Tris緩沖的BSA重新懸起，加0.1的跌氮化鈉，使用前金標的單鏈抗體儲存在4攝氏度冰箱中；

五、免疫試紙條的制備，將1微升的待測抗原和抗6個組氨酸的單克隆抗體分別在室溫固定在硝化纖維素膜上的檢測區和質控區，將純化的膠體金標記單鏈抗體作不同程度稀釋后，均勻等量浸于同樣大小的玻璃纖維素膜制成金標墊，在其他條件不變的情況下，根據反應結果，確定達到試紙條敏感度要求的最適膠體金標記單鏈抗體的稀釋度，或稱為工作濃度，取最適工作濃度的金標抗體以10微升/條加到金標墊上，然后真空冷凍干燥，密封保存。