[發(fā)明專利]基于單鏈抗體的金標試紙的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410059162.2
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103995121A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡學(xué)軍;曹際娟;趙昕;楊春光
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 大連八方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21226
• 代理人: 任洪成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種帶有正電氨基酸短肽標簽通過中性氨基酸短肽融合的單鏈抗體制備金標試紙的方法，可將單鏈抗體廣泛應(yīng)用于金標試紙制備。?

背景技術(shù)

單鏈抗體是最小的重組抗體片段之一，只有全抗體的1/8。單鏈抗體只保留了全抗體和抗原結(jié)合部位，通常以15個氨基酸短肽鏈相連，保持和全抗體抗原結(jié)合區(qū)非常相近的結(jié)構(gòu)，保持與抗原結(jié)合能力。單鏈抗體和全抗體相比，應(yīng)用單鏈抗體可以提高單位面積固定抗體的數(shù)量，大幅提高免疫檢測的的敏感性。?

單鏈抗體固定不穩(wěn)定性是其應(yīng)用于免疫檢測領(lǐng)域的主要障礙。由于其分子小，難于穩(wěn)定固定在固體表面，或固定后部分抗體失去活性。?

目前，固定單鏈抗體的方法主要是通過基因工程法引入特定標簽固定單鏈抗體，如在單鏈抗體C末端或柔鏈間引進組氨酸、精氨酸柔鏈標簽或融合能和材料表面特定分子結(jié)合的短肽標簽，如能與生物素特異結(jié)合的鏈霉素結(jié)合蛋白片段、能與鏈霉素結(jié)合蛋白結(jié)合的短肽、能與聚苯乙烯特異結(jié)合肽或與纖維素結(jié)合蛋白等標簽。但是，在應(yīng)用這些標簽固定單鏈抗體時，單鏈抗體往往失去或者部分與抗原結(jié)合能力，大大降低免疫檢測敏感度。?

膠體金是氯金酸在還原劑作用下可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。用膠體金標記單克隆抗體后，可用于定性或者半定量測量。常用于層析法進行快速檢測。金標記的抗某種抗原的單克隆抗體由于層析作用復(fù)合物沿硝酸纖維膜向前移動，當遇到包被的特異抗原時，復(fù)合物富集在包被線上，形成紅色的沉淀線。如果金標記的單克隆抗體先于待檢測的特異抗原結(jié)合，復(fù)合物就不能與包被抗原的地方富集金標記的抗體，就看不到紅色沉淀線。在包被膜上還有一條質(zhì)控線對照，故當有兩條紅線時判為陰性，當只有質(zhì)控線一條紅線時為陽性。?

目前國內(nèi)外制備膠體金試紙均是用膠體金標記全抗體，尚無利用單鏈抗體制備膠體金試紙的報道。???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種基于單鏈抗體的金標試紙制備方法，是一種帶正電氨基酸短肽標簽通過中性氨基酸短肽融合單鏈抗體制備膠體金試紙的方法，應(yīng)用于金標試紙研制。該標簽組成為：由多聚中性天冬酰胺殘基（8至20個天冬酰胺殘基，表示為N_8-20）與帶正電荷的精氨酸（由5-12個精氨酸組成,?表示為R5-12），或賴氨酸（由5-12個賴氨酸組成,?表示為K5-12），或精氨酸與賴氨酸（6-12個氨基酸，表示為（RK）_3-6）組成的多聚氨基酸短肽共同組成的帶正電的短肽標簽。?

基于單鏈抗體的金標試紙的制備方法，包括以下步驟：?

1.?通過中性氨基酸短肽連接的帶正電標簽單鏈抗體基因表達載體構(gòu)建：（1）在單鏈抗體基因的5′端通過基因重組引入編碼帶正電短肽標簽,融合基因組成依次由編碼帶正電的短肽、中性短肽和單鏈抗體基因。或者在單鏈抗體基因的3′端通過基因重組引入編碼帶正電短肽標簽,融合基因組成依次由編碼單鏈抗體基因、中性短肽和帶正電的短肽標簽組成。帶正電短肽標簽組成：5-12個精氨酸殘基或者5-12個賴氨酸殘基或者6-12個二者混合氨基酸殘基共同組成的短肽標簽，分別以R5-12、K5-12、（RK）3-6表示，R精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基；中性短肽由8至20個天冬酰胺殘基組成，N8-20,?N代表天冬酰胺殘基。在基因的另一端，通過基因重組引入編碼6個組氨酸殘基堿基序列，（2）將以上融合基因構(gòu)建到大腸桿菌質(zhì)周腔表達載體上，融合的單鏈抗體將在大腸桿菌質(zhì)周腔中表達。

2.?將構(gòu)建的單鏈抗體基因質(zhì)周腔表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌工程菌株，將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子進行自誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)表達3-6小時，培養(yǎng)基中添加與表達載體所帶抗性基因相應(yīng)的抗生素。?

3.?收集菌體，提取質(zhì)周腔可溶蛋白，用親和層析方法，分離純化攜帶帶正電標簽的單鏈抗體。?

4.?制備金標單鏈抗體。將0.5毫升（300?納克/毫升）單鏈抗體逐滴加到8毫升的膠體金溶液中（40?納米的膠體金，購置于上海杰一生物技術(shù)有限公司），輕輕混勻。混合液在室溫反應(yīng)1小時。然后，用10%的牛血清白蛋白（BSA）封閉30分鐘。混合液在4攝氏度，以每分鐘14000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄掉上清液，金顆粒沉淀用450微升1%的20?毫摩爾pH8.0的Tris緩沖的BSA重新懸起，加0.1的跌氮化鈉。使用前金標的單鏈抗體儲存在4攝氏度冰箱中。?