[發(fā)明專(zhuān)利]一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410057554.5
• 申請(qǐng)日: 2014-02-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103898186A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林毅;林淑芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P33/20
• 分類(lèi)號(hào): C12P33/20
• 代理公司: 廈門(mén)市首創(chuàng)君合專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法。

背景技術(shù)

海洋中蘊(yùn)藏著極為豐富的資源和能源，而我國(guó)海區(qū)擁有的物種也十分多樣，隨著海洋產(chǎn)業(yè)不斷的快速發(fā)展，越來(lái)越多的企業(yè)家都把目光投向了海洋這塊市場(chǎng)，因此近十幾年來(lái)我國(guó)海洋制藥行業(yè)發(fā)展得十分迅猛，而國(guó)內(nèi)對(duì)棘皮動(dòng)物門(mén)中海參的研究也是一大熱門(mén)的領(lǐng)域。

海參為棘皮動(dòng)物門(mén)（Echinodenmata）海參綱（Holothunoider）生物，全世界的海參有1200多種，我國(guó)海域約有140多種。在海參體壁和內(nèi)臟中，能分泌出一些活性作用很強(qiáng)的物質(zhì)，即海參皂苷，它是海參主要次生代謝產(chǎn)物，也是其進(jìn)行化學(xué)防御的物質(zhì)基礎(chǔ)。藥理實(shí)驗(yàn)表明，海參皂苷大都具有強(qiáng)烈的生理活性作用，如抗腫瘤、抗真菌、抗炎、抗病毒、提高免疫力、溶血性及抗膽堿作用等。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)海參體壁、海參加工廢液、海參體腔液中的皂苷提取工藝進(jìn)行了研究，例如2011年8月17日公開(kāi)的CN102150851A發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的“海參皂苷及其制備方法、在食品藥品中的應(yīng)用”；又如：2011年5月18日公開(kāi)的CN102060905A發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的“利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin?A1對(duì)照品的工藝方法”；還有，2012年6月27日公開(kāi)的CN102512452A發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的“利用海參體腔液制備海參皂苷的工藝方法”。

至今為止，已經(jīng)從海參中分離出至少140多種的海參皂苷。海參皂苷由苷元和寡糖鏈兩部分組成，含有5個(gè)角甲基，苷元的3位上有羥基取代，與糖通過(guò)β-O糖苷鍵結(jié)合成苷。海參皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜多樣，側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)、內(nèi)酯環(huán)的變化、雙鍵的位置以及12、16、17位上的取代基上的變化都會(huì)引起苷元結(jié)構(gòu)的變化，而寡糖鏈的結(jié)構(gòu)會(huì)因單糖的連接位置和順序、單糖的組成和數(shù)目、硫酸酯基的連接位置和數(shù)目等發(fā)生變化。藥理活性研究表明，海參皂苷的活性與苷元、寡糖鏈的結(jié)構(gòu)都有關(guān)系。對(duì)于苷元結(jié)構(gòu)相同、而糖基側(cè)鏈不同的物質(zhì)，它們的藥理活性也有著顯著的差別。因此，改變海參皂苷糖基側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)，有可能得到藥用價(jià)值更高的次生皂苷。

對(duì)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的修飾主要有化學(xué)法、微生物法和酶法。化學(xué)法主要包括酸堿法，雖然操作簡(jiǎn)單，但專(zhuān)一性差，且大量使用有機(jī)溶劑會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染；而很多天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化采用微生物發(fā)酵法，即用微生物產(chǎn)生的代謝酶對(duì)底物進(jìn)行水解，微生物法專(zhuān)屬性較強(qiáng)，條件溫和，環(huán)境污染小，但微生物發(fā)酵法培養(yǎng)條件苛刻，且發(fā)酵需要尋找高效的菌株以滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，相比于化學(xué)法和微生物發(fā)酵法，體外酶法專(zhuān)一性強(qiáng)，酶解效率高，操作簡(jiǎn)單，只要確定酶反應(yīng)的最適條件即可。有關(guān)皂苷類(lèi)的酶法轉(zhuǎn)化研究目前在人參皂苷、三七皂苷、大豆皂苷等取得較大的進(jìn)展。2009年7月15日公開(kāi)的CN101481725A發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的“酶促水解人參皂苷Rb₁制備人參皂苷F₂的方法”中就將含量較高、藥用價(jià)值較低的人參皂苷Rb₁轉(zhuǎn)化成含量較低、藥用價(jià)值較高的人參皂苷F₂。而對(duì)于海參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，目前都還未有相關(guān)的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種酶法轉(zhuǎn)化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，包括以下步驟：

a)將鮮海參去除內(nèi)臟，放入沸水中煮20—30min，得到的即為海參蒸煮液；

b)海參蒸煮液調(diào)節(jié)pH至9.5-10.5，6000-10000r/min離心20-60min得到上清液；

c)上清液過(guò)AB-8型大孔樹(shù)脂柱，分別用3-4倍柱體積的去離子水和20%乙醇溶液沖洗樹(shù)脂，再用5-15倍柱體積的70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集70%乙醇溶液洗脫組分；

d)減壓濃縮所收集的洗脫組分，至浸膏狀，用去離子水復(fù)溶，6000-10000r/min離心20-60min取上清，上清液經(jīng)石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得海參總皂苷；

e)采用蝸牛酶酶解海參總皂苷，緩沖液為pH3.5-4.50.005-0.02μmol/L的磷酸檸檬酸緩沖液，蝸牛酶粗酶與海參總皂苷的重量比例為1：1-3，在水浴鍋中反應(yīng)24-48h，用甲醇終止反應(yīng)，并用0.5-2倍體積的乙醇萃取浸提12-36h；

f)減壓濃縮后，用去離子水復(fù)溶，再用水飽和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇層，減壓濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，即得海參次生皂苷。