[發明專利]一種酶法轉化海參總皂苷制備次生皂苷的方法

有效

• 申請號: 201410057554.5
• 申請日: 2014-02-20
• 公開（公告）號: CN103898186A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 林毅;林淑芳
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明涉及一種酶法轉化海參總皂苷制備次生皂苷的方法。

背景技術

海洋中蘊藏著極為豐富的資源和能源，而我國海區擁有的物種也十分多樣，隨著海洋產業不斷的快速發展，越來越多的企業家都把目光投向了海洋這塊市場，因此近十幾年來我國海洋制藥行業發展得十分迅猛，而國內對棘皮動物門中海參的研究也是一大熱門的領域。

海參為棘皮動物門（Echinodenmata）海參綱（Holothunoider）生物，全世界的海參有1200多種，我國海域約有140多種。在海參體壁和內臟中，能分泌出一些活性作用很強的物質，即海參皂苷，它是海參主要次生代謝產物，也是其進行化學防御的物質基礎。藥理實驗表明，海參皂苷大都具有強烈的生理活性作用，如抗腫瘤、抗真菌、抗炎、抗病毒、提高免疫力、溶血性及抗膽堿作用等。

目前，國內外對海參體壁、海參加工廢液、海參體腔液中的皂苷提取工藝進行了研究，例如2011年8月17日公開的CN102150851A發明專利申請公開的“海參皂苷及其制備方法、在食品藥品中的應用”；又如：2011年5月18日公開的CN102060905A發明專利申請公開的“利用鮮海參加工廢液制備海參皂苷Holotoxin?A1對照品的工藝方法”；還有，2012年6月27日公開的CN102512452A發明專利申請公開的“利用海參體腔液制備海參皂苷的工藝方法”。

至今為止，已經從海參中分離出至少140多種的海參皂苷。海參皂苷由苷元和寡糖鏈兩部分組成，含有5個角甲基，苷元的3位上有羥基取代，與糖通過β-O糖苷鍵結合成苷。海參皂苷的化學結構十分復雜多樣，側鏈的結構、內酯環的變化、雙鍵的位置以及12、16、17位上的取代基上的變化都會引起苷元結構的變化，而寡糖鏈的結構會因單糖的連接位置和順序、單糖的組成和數目、硫酸酯基的連接位置和數目等發生變化。藥理活性研究表明，海參皂苷的活性與苷元、寡糖鏈的結構都有關系。對于苷元結構相同、而糖基側鏈不同的物質，它們的藥理活性也有著顯著的差別。因此，改變海參皂苷糖基側鏈的結構，有可能得到藥用價值更高的次生皂苷。

對天然產物結構的修飾主要有化學法、微生物法和酶法?；瘜W法主要包括酸堿法，雖然操作簡單，但專一性差，且大量使用有機溶劑會對環境造成污染；而很多天然產物的生物轉化采用微生物發酵法，即用微生物產生的代謝酶對底物進行水解，微生物法專屬性較強，條件溫和，環境污染小，但微生物發酵法培養條件苛刻，且發酵需要尋找高效的菌株以滿足工業化生產的需要。因此，相比于化學法和微生物發酵法，體外酶法專一性強，酶解效率高，操作簡單，只要確定酶反應的最適條件即可。有關皂苷類的酶法轉化研究目前在人參皂苷、三七皂苷、大豆皂苷等取得較大的進展。2009年7月15日公開的CN101481725A發明專利申請公開的“酶促水解人參皂苷Rb₁制備人參皂苷F₂的方法”中就將含量較高、藥用價值較低的人參皂苷Rb₁轉化成含量較低、藥用價值較高的人參皂苷F₂。而對于海參皂苷的生物轉化，目前都還未有相關的研究報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種酶法轉化海參總皂苷制備次生皂苷的方法。

本發明的技術方案如下：

一種酶法轉化海參總皂苷制備次生皂苷的方法，包括以下步驟：

a)將鮮海參去除內臟，放入沸水中煮20—30min，得到的即為海參蒸煮液；

b)海參蒸煮液調節pH至9.5-10.5，6000-10000r/min離心20-60min得到上清液；

c)上清液過AB-8型大孔樹脂柱，分別用3-4倍柱體積的去離子水和20%乙醇溶液沖洗樹脂，再用5-15倍柱體積的70%乙醇溶液進行洗脫，收集70%乙醇溶液洗脫組分；

d)減壓濃縮所收集的洗脫組分，至浸膏狀，用去離子水復溶，6000-10000r/min離心20-60min取上清，上清液經石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得海參總皂苷；

e)采用蝸牛酶酶解海參總皂苷，緩沖液為pH3.5-4.50.005-0.02μmol/L的磷酸檸檬酸緩沖液，蝸牛酶粗酶與海參總皂苷的重量比例為1：1-3，在水浴鍋中反應24-48h，用甲醇終止反應，并用0.5-2倍體積的乙醇萃取浸提12-36h；

f)減壓濃縮后，用去離子水復溶，再用水飽和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇層，減壓濃縮后進行冷凍干燥，即得海參次生皂苷。