[發(fā)明專利]一種基于多色上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記同時(shí)檢測三種食源性致病菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410057135.1
• 申請日: 2014-02-20
• 公開（公告）號: CN103940792A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王周平;吳世嘉;段諾;史召;方聰聰
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

一種基于多色上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記同時(shí)檢測三種食源性致病菌的方法，涉及納米材料和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，用于對食品中金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌進(jìn)行檢測。

背景技術(shù)

食源性致病菌是重要的食品危害物質(zhì)之一，其存活繁殖能力強(qiáng)、易傳播，極大的危害人類的生命健康安全。如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等都會通過食物感染人體引發(fā)疾病。更為重要的是，在食品中往往會同時(shí)存在多種食源性致病菌，雖然各自含量不高，但同樣會導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生。因此需要研究出靈敏度高、特異性好的檢測方法能夠同時(shí)檢測多種共存的致病菌。目前傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法檢測需要經(jīng)歷一個長時(shí)間的增菌富集過程，而不同種細(xì)菌各自的生長情況不同，因此同樣的增菌條件和時(shí)間會導(dǎo)致很大的差異。另外，從分子檢測方法來看，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以同時(shí)檢測5到7種細(xì)菌，然而同樣需要增菌和PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)，并且需要提取細(xì)菌DNA用于檢測，是一種間接檢測方法不利于開展現(xiàn)場即時(shí)檢測。近年來，基于熒光免疫分析法構(gòu)建的致病菌檢測方法較為多見，主要是將熒光標(biāo)記物負(fù)載到致病菌的抗體上，通過免疫識別原理結(jié)合對應(yīng)的致病菌，以熒光信號的強(qiáng)度類定量致病菌數(shù)量。熒光免疫分析法的性能主要依賴于信號標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度以及識別分子的特異性和穩(wěn)定性。目前作為標(biāo)記物的熒光基團(tuán)種類很多，包括傳統(tǒng)的熒光染料、量子點(diǎn)和其他多種熒光納米材料。但大多數(shù)熒光染料性質(zhì)不穩(wěn)定易于被光漂白，影響檢測靈敏度，而量子點(diǎn)和其他熒光納米材料雖然改善了熒光淬滅現(xiàn)象，但基于其激發(fā)光仍然在紫外-可見光區(qū)，因此被測生物樣品同樣會被激發(fā)，熒光背景值高，檢測靈敏度仍受到影響。并且由于發(fā)射峰寬大導(dǎo)致發(fā)射峰互相重疊制約了這些材料在多種致病菌同時(shí)標(biāo)記檢測中的應(yīng)用前景。

上轉(zhuǎn)換熒光納米材料(Upconversion?Nanoparticles)就因具有特殊的光學(xué)性能而越來越受到關(guān)注。上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)理是基于雙光子或多光子機(jī)制將長波長的激發(fā)光轉(zhuǎn)換成短波長的發(fā)射光的過程，是一種把紅外光轉(zhuǎn)變成為可見光的有效途徑。因此相對于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料和其他熒光納米材料，上轉(zhuǎn)換材料作為完全惰性的無機(jī)發(fā)光材料具有明顯的優(yōu)勢和極大的應(yīng)用潛能：首先，由于上轉(zhuǎn)換材料是在基質(zhì)中摻雜某些特定稀土元素制備而成的，因此在自然界中不存在天然的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象，利用紅外激光(如980nm)激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，可以在可見光區(qū)得到唯一的上轉(zhuǎn)換熒光發(fā)射，而不會引起其他熒光干擾，因此能夠提高信噪比，建立更靈敏的激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光檢測方法。第二，上轉(zhuǎn)換熒光獨(dú)特的發(fā)光過程主要集中于基質(zhì)材料中，基本不受外界環(huán)境(如濕度、酸度等)和被測物樣品的影響，因此上轉(zhuǎn)換熒光材料特別合適作為復(fù)雜生物樣本中的熒光標(biāo)記物。第三，上轉(zhuǎn)換材料光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易被光漂白，在受強(qiáng)光或激發(fā)光長時(shí)間照射下仍保持很高的光學(xué)穩(wěn)定性。第四，可以通過改變摻雜元素的種類和比例來調(diào)節(jié)上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜，在固定同一激發(fā)波長激發(fā)下得到發(fā)射光譜不同的上轉(zhuǎn)換熒光，真正實(shí)現(xiàn)了單激發(fā)多譜帶發(fā)射，從而有利于上轉(zhuǎn)換材料在生物體系多組分同時(shí)檢測中的應(yīng)用。

另一方面，從識別分子的研究來看，核酸適配體(Aptamer)是從一個體外合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫中通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment，SELEX)技術(shù)篩選得到的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇DNA或RNA片段。這種寡核苷酸序列形成的高級結(jié)構(gòu)具有能識別與之相對應(yīng)的任何類型的蛋白和小分子的靶物質(zhì)，并與靶物質(zhì)有高親和力而形成靶物質(zhì)—適配子的復(fù)合物。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易固定、可反復(fù)使用和長期保存的優(yōu)點(diǎn)，并且核酸適配體作為識別分子在蛋白質(zhì)研究、藥物檢測、醫(yī)學(xué)診斷和食品安全等方面得到了廣泛應(yīng)用。

因此本發(fā)明利用篩選得到的金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的適配體作為識別分子，同時(shí)制備得到三種熒光光譜可分辨的稀土元素?fù)诫s上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子，將其分別于三種適配體結(jié)合形成多色上轉(zhuǎn)換熒光納米探針，以980nm紅外激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光為檢測信號，結(jié)合磁分離富集效應(yīng)，同時(shí)定量檢測三種食源性致病菌，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。該發(fā)明可以用于果蔬、乳制品、肉制品等食品中金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的同時(shí)檢測。

發(fā)明內(nèi)容