[發明專利]一種熱穩定的淀粉酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410056609.0
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103805579A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 吳敬;李祝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/28
• 分類號: C12N9/28;C12N15/70;C12R1/07
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種淀粉酶突變體及其制備方法，特別是一種熱穩定的淀粉酶突變體及其制備方法。

背景技術

α-淀粉酶，系統名稱為α-1,4-葡萄糖-4-葡萄糖水解酶。α-淀粉酶的特點是在淀粉分子鏈中間將α-1,4糖苷鍵切斷，不能水解α-1,6糖苷鍵，也不能水解緊靠1,6分支的α-1,4糖苷鍵，水解產物為可溶性糊精、低聚糖及少量麥芽糖、葡萄糖。α-淀粉酶具有相當大的工業應用價值，廣泛用于酒精、有機酸、氨基酸及紡織等行業。熱穩定淀粉酶生產菌株的獲得主要通過篩選、誘變和酶分子改造獲得。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。誘變包括：自然突變和誘變，自然突變的幾率相當小，誘變的工作量較大且不可控出現負突變的幾率較大。酶分子改造目的性強，針對酶分子具體結構分析進行改造，達到熱穩定性提高的目的。

發明內容

本發明提供了一種熱穩定性淀粉酶突變體，是淀粉酶N端區域與短肽通過PT-linker連接得到的突變體；短肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述淀粉酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述PT-linker序列如SEQIDNO.3所示。

本發明還提供了一種制備所述淀粉酶突變體的方法，其技術方案如下：

1)據短肽和PT-linker序列，采用化學全合成的方法全合成后克隆到質粒pUC57中，構建重組質粒pUC57-P；

2)根據淀粉酶基因序列，采用化學全合成的方法全合成后克隆到質粒pET-20b(+)中，構建重組質粒pET-20b(+)-Amy；

3)針對已分析序列設計引物，將重組質粒pUC57-P中的短肽和PT-linker序列克隆到重組質粒pET-20b(+)-Amy中，構建含有短肽、PT-linker和淀粉酶片段的重組質粒pET-20b(+)-AmyP，將短肽融合到淀粉酶的N端，獲得含有突變淀粉酶序列與短肽序列融合狀態的重組載體；

4)將突變后重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導表達，獲得突變體。

所述短肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述淀粉酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述PT-linker氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

所述淀粉酶突變體在降解、催化淀粉性基質中的應用也屬于本發明要求保護的范圍。

本發明提供的淀粉酶突變體的熱穩定性好，在此改造條件下，嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶在95℃的半衰期由對照(突變前)例的4h提高到7h。相對于采用篩菌或誘變等手段，縮短了酶學性質改造時間。將該熱穩定性提高的淀粉酶突變體應用于淀粉液化等領域，可以在高溫下高效降解淀粉，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1：pET-20b(+)-AmyP質粒圖譜

具體實施方式

實施例1：淀粉酶熱穩定性提高突變分析和方法

通過對淀粉酶3D空間結構進行分析，確定區域A(催化區域)、區域B、區域C。根據淀粉酶的氨基酸序列及結構相關性，選用短肽與淀粉酶序列進行融合表達，提高其熱穩定性。

據短肽和PT-linker序列，采用化學全合成的方法全合成后克隆到質粒pUC57中，構建重組質粒pUC57-P。同時根據嗜熱脂肪芽孢桿菌的淀粉酶序列，采用化學全合成的方法全合成后克隆到質粒pET-20b(+)中，構建重組質粒pET-20b(+)-Amy。針對已分析序列設計引物，將重組質粒pUC57-P中的短肽和PT-linker序列克隆到重組質粒pET-20b(+)-Amy中，獲得含有突變淀粉酶序列與短肽序列融合狀態的重組載體pET-20b(+)-AmyP（圖1）。突變后重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導表達，獲得突變體。短肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；淀粉酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；PT-linker氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

實施例2：淀粉酶活力測定方法

DNS法測定淀粉酶酶活：

1)DNS試劑的配制：稱取6.5g3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中，移入1L容量瓶中，加入2mol/L氫氧化鈉溶液262mL，再加入185g酒石酸鉀鈉及5g苯酚和5g無水亞硫酸鈉，定容至1L，儲存至棕色瓶中，放置于4℃冰箱待用。