[發明專利]一種牡丹基因組DNA分子標記方法

有效

• 申請號: 201410055992.8
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103820546A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 郭大龍;侯小改;段亞賓;魏冬峰;呂靜霞
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

技術領域

本發明涉及一種分子標記法，具體的說是一種牡丹基因組DNA分子標記方法。

背景技術

牡丹（Paeonia?Suffruticosa?Andr.）為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia??L.）?牡丹組（Sect.?Mouton?DC.）落葉灌木，是重要的觀賞綠化植物和資源植物，其花大形美、色艷香濃，為歷代人們所稱頌，是我國著名的傳統名花，在中國已有2000余年的栽培應用歷史。我國牡丹在長期的栽培馴化過程中，形成了以中原、西北、江南和西南等品種群為代表的，具有不同花瓣顏色、數目、花型和葉型的栽培品種1000多個，栽培區域遍及全國各地。牡丹組共有9個種，（洪德元和潘開玉，1999；Hong和Pan,2007），分布于河南、甘肅、陜西、山西、安徽、湖北、四川、云南和西藏等9個省區。

其它作物上的研究表明反轉錄轉座子與基因組的進化，性狀的變異等密切相關。已有研究表明反轉錄轉座子是植物基因組進化的主要動力，借助于反轉錄轉座子可以準確獲得種質間的進化關系。牡丹種質資源遺傳多樣性豐富，遺傳變異大，但對于種質間的進化關系還未了解清楚。

分子標記技術可從?DNA?水平上檢測生物體的遺傳多樣性，不受基因表達和環境條件的影響，其操作簡單快速，易實現自動化，廣泛應用于植物遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標記輔助育種等方面。目前應用較多的分子標記技術主要有RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP等。反轉錄轉座子分子標記較傳統的分子標記具有諸多優勢，其檢測的多態性信息含量明顯高于傳統分子標記。近年來，隨著研究的逐漸深入，基于反轉錄轉座子的分子標記方法也在增加，其中最常用的主要是SSAP、IRAP、REMAP、RBIP四種，已廣泛用于植物種質資源及遺傳育種研究。基于反轉錄轉座子的分子標記與常規分子標記技術比較，反轉錄轉座子最大的優勢在于它能覆蓋全基因組，提供的信息更豐富，可作為高通量標記分析，具有很大的發展潛力。與RFLP、RAPD、SSR和AFLP等常規DNA標記檢測多態性不同，基于反轉錄轉座子的標記技術的多態性來源于其結構、組成、分布和逆轉座的生物學過程。

反轉錄轉座子分子標記是目前應用廣泛的分子標記技術，已被應用于大麥、玉米、小麥、蘋果、葡萄等多種植物。利用反轉錄轉座子分子標記不僅可以有效地進行體細胞克隆變異的鑒定，還可以有效地進行遺傳作圖和農藝性狀基因的標記，用于生物多樣性和系統進化關系分析。其中，SSAP(Sequence-specific?amplification?polymorphism)是一種可以檢測反轉錄轉座子和與其鄰近的酶切位點之間DNA片段擴增多態性的反轉錄轉座子分子標記。其原理和操作流程類似于AFLP，只是在進行選擇性擴增時除了一個能與接頭同源配對的引物外，另一個引物根據反轉錄轉座子的LTR（長末端重復序列）末端保守序列來設計。SSAP由限制性內切酶消化基因組DNA，然后連接接頭，再分別進行預擴增和選擇性擴增，通過同一位置片段的有無來判斷其多態性。多態性來源于限制性位點及其兩側序列的變異，這點與AFLP相同，而LTR5'末端和反轉錄轉座子插入位點的變異所產生的多態性是AFLP所沒有的，因此SSAP標記方法不僅可以檢測插入位點的多態性，又可識別反轉錄轉座子內部變異，但其實施是建立在反轉錄轉座子兩端LTR序列分離的基礎上。若想開展此類標記，必須先得到反轉錄轉座子LTR序列，而目前分離LTR序列方法的效率還較低。

發明內容

本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其為牡丹的種質資源遺傳變異和進化研究提供新的技術手段而且更加簡單、高效，實用，大大簡化了試驗程序，大大的降低了應用難度。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案是：一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于：其具體操作步驟為：

步驟一、提取牡丹基因組DNA；

步驟二、牡丹基因組DNA的酶切：用限制性內切酶Mse?I和限制性內切酶EcoR?I對上述步驟一所提取的基因組DNA進行酶切，得到基因組DNA酶切產物；

所述基因組DNA酶切的酶切體系為20μL，包括濃度為50ng/μL基因組DNA5-10μL，稀釋10倍后的緩沖液4?2.0μL，稀釋100倍后的牛血清蛋白?0.2μL，Mse?I酶0.5μL，EcoR?I酶0.5μL，余量為雙蒸水。