[發明專利]一種牡丹基因組DNA分子標記方法

有效

• 申請號: 201410055992.8
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103820546A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 郭大龍;侯小改;段亞賓;魏冬峰;呂靜霞
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

1.一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于：其具體操作步驟為：

步驟一、提取牡丹基因組DNA；

步驟二、牡丹基因組DNA的酶切：用限制性內切酶Mse?I和限制性內切酶EcoR?I對上述步驟一所提取的基因組DNA進行酶切，得到基因組DNA酶切產物；

步驟三、酶切產物和接頭DNA連接：將所得基因組DNA酶切產物、Mse?I接頭引物、EcoR?I接頭引物、T4?DNA連接酶和稀釋10倍后的連接緩沖液混合均勻后在溫度為16℃的條件下保溫30min，得到連接產物；

所述的Mse?I接頭引物序列包括Mse?I?5'端接頭引物和Mse?I?3'端接頭引物，其堿基序列如序列表序列1和序列2；

所述的EcoR?I接頭引物序列包括EcoR?I?5'端接頭引物和EcoR?I?3'端接頭引物，其堿基序列如序列表序列3和序列4；

步驟四、連接產物的預擴增：

（1）、取上述步驟三所得部分連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg²⁺的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20μmol/L的Mse?I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到Mse?I預擴增產物；

（2）、取上述步驟三所得剩余連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg²⁺的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20μmol/L的EcoR?I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到EcoR?I預擴增產物；

所述的Mse?I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列5；所述EcoR?I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列6；

步驟五、選擇性擴增：取上述步驟四得到的Mse?I預擴增產物和EcoR?I預擴增產物，分別用雙蒸水稀釋20-40倍后，將其與用雙蒸水稀釋至20μmol/L的內切酶接頭選擇性擴增引物、用雙蒸水稀釋至20μmol/L的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀釋10倍后的緩沖液和雙蒸水混合均勻后，進行PCR擴增，得PCR選擇性擴增產物；

所述內切酶接頭選擇性擴增引物為堿基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse?I選擇性擴增引物中的任意一條，或者堿基序列如序列表序列10和序列11的EcoR?I選擇性擴增引物中的任意一條；

所述的iPBS引物為堿基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一條；

步驟六、將所得PCR選擇性擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察結果。

2.如權利要求1所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于：所述步驟二中基因組DNA酶切體系總量為20μL，包括濃度為50ng/μL基因組DNA5-10μL，稀釋10倍后的緩沖液4?2.0μL，稀釋100倍后的牛血清蛋白?0.2μL，Mse?I酶0.5μL，EcoR?I酶0.5μL，余量為雙蒸水。

3.如權利要求1所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于：所述步驟三的操作方法為：在微量PCR離心管中，加入基因組DNA酶切產物8μL，Mse?I接頭引物2.5μL、EcoR?I接頭引物2.5μL、T4?DNA連接酶1μL、稀釋10倍后的連接緩沖液?2.5μL，之后用雙蒸水補齊至25μL；用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16℃的條件下保溫30min，得到連接產物。

4.如權利要求1所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于：所述步驟四的操作方法為：在微量PCR離心管中，加入連接產物2.5μL，稀釋10倍后的緩沖液?2.5μL，含Mg²⁺的溶液?1.875μL、dNTPs?0.5μL、Mse?I預擴增引物0.5μL、EcoR?I預擴增引物0.5μL、Taq酶0.2μL，之后用雙蒸水補齊至25μL，置于PCR儀中，進行PCR預擴增。

5.如權利要求4所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于：所述的PCR預擴增，具體PCR程序為94℃?1min；50℃?90s，?72℃?90s，36?個循環；72℃?10min。