[發明專利]一種牡丹SINE類轉錄轉座子序列的分離方法

有效

• 申請號: 201410055967.X
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103820467A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 侯小改;郭大龍;宋程威;郭麗麗;劉素云;段亞賓
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/63
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

技術領域

????本發明涉及一種轉錄轉座子序列的分離方法，具體的說是一種牡丹SINE類轉錄轉座子序列的分離方法。

背景技術

牡丹是我國的傳統名花，觀賞栽培歷史悠久，唐、明、清三朝牡丹皆為國花，身價之高，無與倫比，被尊為“花中之王”。時至今日，在我國冰天雪地的北方、風和日麗的江南，甚至在溫暖炎熱的南方，都能欣賞到牡丹，極具觀賞價值。各地的牡丹展覽、牡丹花會、牡丹書畫、牡丹攝影等牡丹主題的活動帶來很高的經濟效益。對牡丹進行遺傳多樣性分析、構建核心種質、種植資源分類鑒定等方面得到廣泛應用，并取得了顯著成果，對加快牡丹育種、提高育種效率具有重要意義。

反轉錄轉座子是散布于基因組中的中度重復序列，由于它的的轉座作用以及它與其LTR之間的同源重組導致的基因組的多樣性，在真核生物基因組中反轉錄轉座子是核?DNA的主要組分（占核DNA量的50%，部分禾本科植物甚至達到80%）。非LTR類反轉錄轉座子在植物基因組中廣泛存在并扮演極其重要的角色，正越來越受到人們的關注。SINE類反轉錄轉座子結構簡單，短小且易于改造，具有很好的應用前景。其具有廣泛存在、高拷貝數、高異質性，插入位點不可逆等特點，對基因組的大小、結構、功能和進化都具有重要的作用，近年來成為基因克隆、基因表達及其功能、生物多樣性及系統發育進化研究的重要工具。由于以上特性，使植物的反轉錄轉座子很容易作為一種分子標記，應用于遺傳變異的研究中。

發明內容

本發明提供一種牡丹SINE類轉錄轉座子序列的分離方法，采用磁珠探針復合物的方法來分離SINE類反轉錄轉座子序列，分離出的牡丹SINE類反轉錄轉座子序列，為以后開發基于牡丹SINE類反轉錄轉座子的分子標記提供基礎。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案是：一種牡丹SINE類轉錄轉座子序列的分離方法，其具體操作步驟為：

步驟一、牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列的分離：根據真核生物SINE類反轉錄轉座子的保守序列Box?A和Box?B區域，以兩個單引物分別進行PCR擴增，將兩次PCR擴增出的產物，進行克隆及陽性菌篩選以后，測序，進行序列分析，得到牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列；

所用的兩個單引物序列為：

引物A??5'-TGGCCTAGTGG-3'；

引物B??5'-GAGGAYTTG?AACC-3'；

所述的用兩個單引物進行PCR擴增的反應體系和反應程序分別為：

引物A的PCR反應體系為：在PCR管中配制50μL的反應液II，其成分為：8?μL的基因組DNA、6μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR緩沖液、2.5?μL的磷酸脫氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq?DNA聚合酶、2.5μL的PCR引物，余量為滅菌雙蒸水；A-PCR反應程序為：將配好的PCR反應液II放入PCR儀內，進行PCR反應，反應程序為：94℃預變性5?min；94℃變性1?min，43℃退火1?min，72℃延伸2?min，進行34個循環；72℃終延伸8?min；

引物B的PCR反應體系為：在PCR管中配制20?μL的反應液I，其成分為：8?μL的基因組DNA、5μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR緩沖液、2μL的磷酸脫氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq?DNA聚合酶、2.5?μL的PCR引物，余量為滅菌雙蒸水；B-PCR反應程序為：將配好的PCR反應液I放入PCR儀內，進行PCR反應，反應程序為：94℃預變性2?min；94℃變性30?s，44℃退火45?s，72℃延伸1?min，進行32個循環；72℃終延伸10?min。

步驟二、生物素標記的探針的制備：根據步驟一中所得到的牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列設計5’端生物素標記的探針引物，以質粒DNA為模板進行PCR，得到生物素標記的探針；具體操作步驟如下：

（1）根據步驟一中所得到的牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列，設計引物，引物序列（其基因序列如基因序列表序列3和序列4）為：

PTSB01??5'-TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG-3'；

PTSB02??5'-AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA-3'；

其中PTSB01進行5’端生物素標記；