[發明專利]一種牡丹SINE類轉錄轉座子序列的分離方法

有效

• 申請號: 201410055967.X
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103820467A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 侯小改;郭大龍;宋程威;郭麗麗;劉素云;段亞賓
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/63
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

1.一種牡丹SINE類反轉錄轉座子序列的分離方法，其特征在于，具體操作步驟為：

步驟一、牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列的分離：根據真核生物SINE類反轉錄轉座子的保守序列Box?A和Box?B區域，以兩個單引物分別進行PCR擴增，將兩次PCR擴增出的產物，進行克隆及陽性菌篩選以后，測序，進行序列分析，得到牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列；

所用的兩個單引物序列為：

引物A??5'-TGGCCTAGTGG-3'；

引物B??5'-GAGGAYTTG?AACC-3'；

步驟二、生物素標記的探針的制備：根據步驟一中所得到的牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列設計5’端生物素標記的探針引物，以質粒DNA為模板進行PCR，得到生物素標記的探針；

所設計的生物素標記的探針引物的序列為：

PTSB01?5'-TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG-3'；

PTSB02?5'-AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA-3'；

其中PTSB01進行5’端生物素標記；

步驟三、基因組片段富集庫的制備：提取牡丹基因組DNA，然后以限制性內切酶Bsp143I進行基因組酶切，得到基因組酶切片段；同時將兩條寡聚核苷酸鏈退火，形成雙鏈的寡聚核苷酸接頭，之后通過T4連接酶將酶切后的基因組片段與接頭連接，并以單引物的PCR擴增，進行基因組片段庫的富集，得基因組片段，備用；

形成雙鏈的寡聚核苷酸接頭的兩條寡聚核苷酸鏈分別為：

Adaptor?1???????5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGT-3'；

Adaptor?2????????3'-CCCGGCTCCACTAG-5'；

單引物的PCR擴增進行基因組片段庫的富集，所用引物為：

Adapcr?????5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'；

步驟四、目的片段的篩選、擴增與測序：將生物素標記的探針與步驟三中所得基因組片段雜交，通過MagneSphere磁珠篩選出目的片段；將篩選出的片段進行接頭PCR，將反應產物進行克隆及陽性菌篩選以后，進行測序和序列分析，得到牡丹SINE類反轉錄轉座子序列。

2.如權利要求1所述的牡丹SINE類反轉錄轉座子序列的分離方法，其特征在于：步驟一中所述的用兩個單引物進行PCR擴增的反應體系和反應程序分別為：

引物A的PCR反應體系為：在PCR管中配制50μL的反應液II，其成分為：8?μL的基因組DNA、6μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR緩沖液、2.5?μL的磷酸脫氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq?DNA聚合酶、2.5μL的PCR引物，余量為滅菌雙蒸水；A-PCR反應程序為：將配好的PCR反應液II放入PCR儀內，進行PCR反應，反應程序為：94℃預變性5?min；94℃變性1?min，43℃退火1?min，72℃延伸2?min，進行34個循環；72℃終延伸8?min；

引物B的PCR反應體系為：在PCR管中配制20?μL的反應液I，其成分為：8?μL的基因組DNA、5μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR緩沖液、2μL的磷酸脫氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq?DNA聚合酶、2.5?μL的PCR引物，余量為滅菌雙蒸水；B-PCR反應程序為：將配好的PCR反應液I放入PCR儀內，進行PCR反應，反應程序為：94℃預變性2?min；94℃變性30?s，44℃退火45?s，72℃延伸1?min，進行32個循環；72℃終延伸10?min。