[發明專利]一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統及其制備方法

有效

• 申請號: 201410055627.7
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103789348A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 孫敏捷;謝穎;張燦;平其能;張斐然
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;A61K48/00
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

技術領域

本發明涉及藥物制劑領域和生物醫藥技術領域，具體來說涉及一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統及其制備方法。

背景技術

隨著基因工程、納米技術、現代醫藥技術等學科的發展，從基因水平治療疾病正在成為一種極具前途的治療手段。基因治療是通過將核酸（DNA，siRNA，miRNA）導人組織和細胞，調控涉及疾病發生、發展的關鍵蛋白的表達，從而達到疾病治療的目的。但核酸分子由于其分子量大、帶負電性、親水的特征，不能有效進入細胞；另外，核酸分子極易被血漿蛋白中的核酸酶降解。所以核酸分子需要由載體包載才能實現給藥治療的目的。

將核酸導入細胞進行表達是實現基因治療的關鍵步驟，成功的基因治療依賴于有效的基因載體。常見的載體分為病毒類載體和非病毒載體，其中，病毒類載體包括逆轉錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等，但是病毒類載體容易引起人體的免疫性反應，在臨床應用中存在著較大的安全隱患。非病毒載體主要是由陽離子聚合物或脂質與核酸通過靜電吸附制備得到得到的陽離子載體，與病毒載體相比，非病毒載體具有安全、有效、無免疫原性等優點。陽離子載體能有效包裹核酸，促進核酸進入細胞。但陽離子非病毒載體通常有由于陽離子特性帶來的細胞毒性，且易于在血漿中沉淀，從而抑制其體內的給藥治療。

磷酸鈣沉淀法廣泛用于細胞轉染，磷酸鈣有良好的生物相容性、生物降解性，并且能夠有效的包載核酸分子。另外，磷酸鈣具有酸敏感性，在溶酶體酸性環境下，磷酸鈣解離得到鈣離子、磷酸根離子，增加溶酶體滲透壓，促進溶酶體膜破裂，促使核酸分子實現溶酶體逃逸。但磷酸鈣的膠體穩定性差，制備后快速沉淀，缺乏制備的重復性；沉淀的磷酸鈣粒子且會引起細胞毒性。膠體穩定性差阻止了磷酸鈣的體內應用。

制備穩定的磷酸鈣納米粒子成為實現核酸體內安全、有效遞送的有效途徑。Leaf?Huang等制備了脂質體包裹的磷酸鈣雜化納米粒，實現了靜脈注射后核酸的系統遞送，他們采用的是反向微乳法制備了穩定的脂質包覆磷酸鈣納米粒（Li?J,Chen?YC,Tseng?YC,Mozumdar?S,Huang?L.Biodegradable?calcium?phosphate?nanoparticle,with?lipid?coating?for?systemic?siRNA?delivery.Journal?of?controlled?release.2010;142:416-21.）。中國專利申請（200910264114.6）授權了“一種載有基因的磷酸鈣復合納米粒及其制法與用途”，也采用了微乳法制備磷酸鈣納米粒。但這種制備方法相對復雜且用到了有潛在毒性的有機溶劑和表面活性劑，不利于擴大生產。

于是，我們嘗試開發一種新型的雜化納米磷酸鈣基因載體，該載體具有制備簡單、經濟成本低、使用方便、轉染效率高、生物相容性好、可用于體內注射給藥等綜合優勢，這對基因治療的發展有重大意義。

發明內容

本發明的目的在于開發一種新型的基因遞送系統，提高基因的體內外轉染效率，促進基因治療的發展。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統，包括磷酸鈣及PEG接枝羧甲基殼聚糖，其特征在于，磷酸鈣包裹基因形成內核，PEG接枝羧甲基殼聚糖包覆于內核表面，PEG鏈段形成親水性外殼，從而形成具有PEG化核殼結構的納米粒子，其中所述PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為1～100萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20～90%，PEG分子量為500～10000，PEG接枝率為8%～60%，并且該納米粒子的粒徑為60～100nm。

優選地，所述PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為10～40萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為40～70%，PEG分子量為2000～6000，PEG接枝率為20%～40%。

本發明更提供一種制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統的方法，包括以下步驟：

1）制備試劑a，包含鈣鹽、緩沖劑，余量為水；

2）制備試劑b，包含PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉、緩沖劑，余量為水；

3）將基因與試劑a混合，再與試劑b等體積混合均勻，

其特征在于，

在所述試劑a中，鈣鹽為CaCl₂、Ca(NO₃)₂中的一種或兩種任意比例的組合，緩沖劑為Hepes、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一種或兩種以上的任意比例組合；