[發明專利]一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法

有效

• 申請號: 201410055606.5
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103808550A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 陸宏達;毛毛;竹攸汀;李振偉;盧俊;余偉楠;柴下
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N21/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于生物學領域，具體而言，涉及一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法。

背景技術

粘孢子蟲（Myxosporea）是一類種類繁多的寄生蟲。目前，發現的粘孢子蟲種類已超過2200種，并且每年都有新種被發現。除少數種類寄生在兩棲動物、水禽及哺乳動物外，絕大多數寄生于魚類不同組織器官上，嚴重影響寄主的健康生長。粘孢子蟲作為最為常見的魚類等水生動物寄生蟲之一，經常在科研或教學中被研究觀察。

目前最常用的粘孢子蟲的觀察方法：事先把患粘孢子蟲的病魚保存在福爾馬林溶液中，需要觀察時，從溶液中取出粘孢子蟲的孢囊，制作水浸片，然后在顯微鏡下觀察。這種方法明顯有如下缺點：其一、粘孢子蟲基本透明，在顯微鏡下折光率低，不容易看清楚其形態結構（圖2、圖4、圖6）；其二、水浸片中的粘孢子蟲位置不固定，會隨液體而流動，不利于顯微鏡下蟲體結構觀察和拍照；其三、每次觀察都要制作水浸片，耗時耗力，浪費粘孢子蟲樣品和玻片；其四、用于長期保存粘孢子蟲的福爾馬林溶液有效成分為甲醛，有刺激氣味，有毒，制作水浸片過程影響使用者身體健康。

發明內容

為了彌補上述缺陷，本發明自創出一種簡單易行，便于攜帶，觀察效果好，一次做好可常年保存并且可反復使用的粘孢子蟲玻片標本的制作方法，以期給寄生蟲實驗科研和教學帶來便利。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案：

本發明涉及一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）粘孢子蟲懸浮液制作：從保存于福爾馬林中的患粘孢子蟲病病魚上取出孢囊放入適量蒸餾水中，弄破孢囊使得粘孢子蟲分散懸浮于蒸餾水中，粘孢子蟲懸浮液中的孢子蟲盡可能有較高濃度，一般以0.01～1×10⁶/ml為最宜；

（2）甘油蛋白粘性玻片制作：用大頭針取芝麻大小的甘油蛋白均勻涂在載玻片上，用滴管滴2～3滴粘孢子蟲懸浮液于甘油蛋白粘性玻片上，搖晃玻片使粘孢子蟲懸浮液均勻地分布于玻片上；

（3）烘片：把帶有粘孢子蟲的玻片在38～42℃干燥箱里烘干，以玻片上液體剛蒸發了為止；或者可以自然條件下晾干；

（4）染色：用滴管吸取瑞氏-姬姆薩A液（常規血細胞染色用瑞氏染液和姬姆薩1：1混合液）0.5～0.8ml覆蓋于帶有粘孢子蟲的烘干玻片上，染色5～8min；再將瑞氏-姬姆薩B液（pH=6.4～6.8的磷酸鹽緩沖液）滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微風使得液面產生漣漪狀而充分混合，染色8～10min；用蒸餾水緩慢細流沖掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸餾水變為無色為止；

（5）脫色洗片：把染好的玻片浸入甲醇溶液中1～3min進行脫色洗片；

（6）脫水及封片：脫色的洗片依次經過70%、80%、95%、100%梯度酒精分別脫水2min，然后分別經二甲苯純酒精1：1混合液和二甲苯2min后用中性樹膠封片。

在本發明的一個優選實施方式中，所述的甘油蛋白為甘油（丙三醇）與雞蛋蛋清1:1體積比的混勻液。

本發明中，粘孢子蟲（Myxosporea）是一類種類繁多的寄生蟲。目前，發現的粘孢子蟲種類已超過2200種，并且每年都有新種被發現。除少數種類寄生在兩棲動物、水禽及哺乳動物外，絕大多數寄生于魚類不同組織器官上。為了在取材上更具代表性，本發明的技術方案選用標本是單極囊的武漢單極蟲（Thelohanellus?wuhanensis）和雙極囊的咽碘泡蟲（Myxobolus?pharynae），兩種蟲體均屬于碘泡蟲屬（Myxobolus?Bütschli,1882），碘泡蟲屬是粘孢子蟲種類最多的一個屬，目前已經超過820種，超過粘孢子蟲全部種類的1/3。所以，雖然本發明優選了單極囊的武漢單極蟲和雙極囊的咽碘泡蟲，但本發明的方法具有普遍意義，其它粘孢子蟲的染色封存也可以采用該方法進行。

本發明所述的方法具有如下優點：

（1）用玻片標本成品觀察粘孢子蟲形態效果好：在40倍物鏡下，粘孢子蟲孢質被染成深藍色、極囊被染成淺紫紅色、殼片不著色，這樣極囊、孢質和殼片界線分明，整個孢子的形態結構顯得一目了然（圖3、7）；在100倍油鏡下，極囊極絲著色較深，極囊其它部分著色較淺，極絲的結構顯得清晰可見（圖5）。這樣就克服了傳統粘孢子蟲顯微鏡下觀察，折光率低，蟲體形態結構不清晰的弊端。

（2）標本制作最后采用梯度酒精脫水后中性樹膠封片，做好的玻片標本可常年保存樣品，多次重復使用，節約玻片等耗材，而且攜帶方便，可作為實驗教學上粘孢子蟲形態結構觀察玻片標本實驗材料。