[發明專利]氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在DNA測序中的用途

有效

• 申請號: 201410055242.0
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103804447A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 沈玉梅;魏曉飛;龔兵;胡蔚;姜玉;趙小東;邵志峰;李小衛;伍新燕;湯道年;劉亞智
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07H19/167
• 分類號: C07H19/167;C07H19/173;C07H19/20;C07H1/00;C07H1/04;C09K11/06;C12Q1/68
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術領域

本發明涉及化學合成和生物化學領域，具體涉及一種氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在DNA測序中的用途。

背景技術

2001年人類基因組工作草圖的發表，標志著后基因組時代的到來，人們對測序技術的需求沒有減少反而增加，DNA測序技術依舊處于高速發展時期。近年來，人類基因組計劃促進了DNA測序效率的提高和測序成本的下降，但是目前的DNA測序方法依然存在成本高和耗時長的問題，這影響了DNA測序技術的市場化應用，阻礙了科學的發展。科學家們一直致力于發展高通量、低成本的測序技術，因此，三代高通量測序技術即單分子測序技術應運而生。

三代測序技術的核心是直接對單個DNA分子進行測序，不做任何的DNA擴增反應，從而減少成本，提高通量。單分子測序技術雖然已有商業化產品，但是都還存在技術上的難點，尚未達到規模化測序的要求。盡管如此，當前國內市場上的高通量測序平臺仍被進口產品所壟斷，產品范圍涵蓋了測序平臺中的硬件和試劑等配套產品。因此，國家863計劃、973計劃和“十二五”技術都將研發新一代測序技術及配套產品的研發列為重點發展方向，旨在改變目前的市場格局，建立我國自主的高通量測序平臺，是一項具有戰略性的意義工作。

DNA合成測序的可逆終端選取U，C，A，G四個堿基的核苷酸與敏感性連接單元和熒光標記化合物，通過化學合成方式得到。合成測序的首要工作是合成四個不同堿基核苷酸及其衍生物。文獻報道發現，四個不同堿基(U，C，A，G)的含取代基核苷及其衍生物，合成方式復雜且價格高昂。與此同時，8位取代氮的鳥嘌呤核苷被證明具有優良的生物活性和測序識別效果，但該種鳥嘌呤核苷及其衍生物的合成報道尚未報道。合成8位取代氮的鳥嘌呤核苷及其衍生物具有廣闊的理論研究價值和市場應用前景。我們在專利申請CN201310489397.0，CN201310489350.4中分別報道了鳥嘌呤核苷兩種不同的合成方法，本發明中8位取代氮的鳥嘌呤核苷包括7-去氮-7-鹵素-8-氮-2’-脫氧鳥嘌呤核苷和7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷，其具有更佳的測序識別效果和生物活性，并且合成方法更高效而實用，反應條件溫和，反應過程有效且可控，適用于大規模生產。專利CN201310489350.4和專利CN201310489397.0中，糖苷化反應所需原料價格高昂，反應的產率很低，不適用于規模化生產。本專利中選取簡單易得的原料，高產率地首次合成了7-去氮-7-鹵素-8-氮-2’-脫氧鳥嘌呤核苷和7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷，進而合成得到可被聚合酶識別的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脫氧鳥嘌呤核苷酸和7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鳥嘌呤核苷酸，從而參與DNA與RNA鏈延伸反應，達到單分子測序的效果。

發明內容

本發明的目的在于提供一種氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在DNA測序中的用途。具體提供了氮雜化鳥嘌呤核苷酸的合成方法，中間體化合物7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷、7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脫氧鳥嘌呤核苷酸以及化合物7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鳥嘌呤核苷酸的合成方法；本發明的方法合成原料簡單易得，反應條件溫和，作簡單，適用于規模化生產。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

第一方面，本發明涉及一種7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷的合成方法，所述方法包括如下步驟：

A、式(Ⅲ)化合物在堿性條件下去保護基得式(Ⅱ)化合物；

B、所述式(Ⅱ)化合物在堿性條件下去甲基得式(Ⅰ)化合物，即所述7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷；

其中，R₁為H或OH，R₂為I、Br或Cl，R₃為H或

步驟A中，R₃為H時，生成式(Ⅱ1)化合物；R₃為時，生成式(Ⅱ2)化合物。

其中，R₂為I、Br或Cl。

優選地，所述式(Ⅲ)化合物通過式(Ⅳ)化合物與式(Ⅵ)化合物發生糖苷化反應制備而得。

其中，R₂為I、Br或Cl，R₃為H或

優選地，所述式(Ⅳ)化合物通過在式(V)化合物嘌呤堿基的7位上接上鹵素原子制備而得，

優選地，所述式(V)化合物是通過如下步驟制備而得的：