[發明專利]一種P2X7-PANX1雙表達載體、穩定系細胞、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201410055164.4
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN104293818A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 李超堃;魏林郁;單琳琳;李新娟;王國紅;李娜;李超科;李東亮
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明具體涉及一種P2X₇-PANX1雙表達載體，以及轉染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩定系細胞，同時還涉及雙表達載體、穩定系細胞的制備方法及穩定系細胞應用，屬于生物技術領域。?

背景技術

三磷酸腺苷（ATP）是細胞能量供應和利用的物質形式，正常情況下胞外ATP（ATPe）含量很低。在中樞神經系統中，ATPe具有遞質活性，往往稱為膠質遞質。與ATPe結合的嘌呤能受體分P2Y和P2X兩類，前者屬于G-蛋白偶聯型受體，后者是離子通道型受體。P2X嘌呤受體有7個亞型，其中P2X₇受體（P2X₇R）最有特點，受體屬陽離子通道，一價、二價的陽離子均可通過。ATP是其天然配體，生理濃度（微摩爾水平）ATPe激活P2X₇R可選擇性地引起Ca²⁺、Na⁺內流，細胞去極化，神經細胞產生正常的興奮活動。?

當神經系統受損后，死亡的細胞大量ATP釋放到胞外，隨后損傷周圍區的ATPe濃度和P2X₇R表達上調，繼而引起神經元繼發性損傷。最新的觀點表明ATP是一種死亡因子，而P2X₇R是凋亡和壞死的主要介導者。同時也指出ATPe短暫作用于P2X₇R，僅形成允許陽離子透過的通道；而高濃度ATPe，反復持久作用于P2X₇R，形成允許各種陽離子和900D以下的有機物質通過的膜孔，結果導致大量小于900Da的物質透出胞膜，而膜孔的形成基礎是PANX1耦合在P2X₇形成的復合體上，PANX1被激活后細胞內穩態失衡而死亡，因此，PANX1-P2X₇膜孔形成和激活是細胞死亡的最終通路。?

凡是能影響P2X7受體激活以及PANX1通道膜孔形成的因素均可以有效干預細胞的凋亡和壞死，研究二者關系及激活模式是未來理論研究和藥物開發應用的基礎。?

發明內容

本發明的目的是提供一種P2X₇-PANX1雙表達載體。?

其次，本發明還提供一種P2X₇-PANX1雙表達載體的制備方法。?

同時，本發明提供一種轉染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩定系細胞。?

最后，本發明提供一種轉染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩定系細胞的應用。?

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：?

一種P2X₇-PANX1雙表達載體，含有如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序?列。?

具體的，P2X₇-PANX1雙表達載體，含有如SEQ?ID?NO.17、SEQ?ID?NO.18所示的核苷酸序列。?

一種P2X₇-PANX1雙表達載體的制備方法，包括以下步驟：?

（1）利用PCR擴增P2X₇基因，將擴增產物連接到pEGFP-N1載體上，獲得陽性重組質粒pP2X₇-EGFP，擴增P2X₇基因的引物序列如SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示；?

（2）利用PCR擴增PANX1基因，將擴增產物連接到pDsRed-N1載體上，獲得陽性重組質粒pPANX1-RFP，擴增PANX1基因的引物序列如SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6所示；?

（3）利用PCR擴增pPANX1-RFP質粒上CMV:PANX1-dsRED-PloyA完整調控框架，利用PCR反向擴增pP2X₇-EGFP質粒骨架，兩種擴增產物混合后直接轉化宿主菌，挑取陽性克隆并提取質粒，鑒定即得P2X₇-PANX1雙表達載體，用于pPANX1-RFP質粒的引物序列如SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.8所示，用于P2X₇-GFP質粒的引物序列如SEQ?ID?NO.9、SEQ?ID?NO.10所示。?

一種轉染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩定系細胞，制備方法包括如下步驟：?