[發(fā)明專利]一種P2X7-PANX1雙表達載體、穩(wěn)定系細胞、制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410055164.4
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN104293818A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李超堃;魏林郁;單琳琳;李新娟;王國紅;李娜;李超科;李東亮
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種P2X₇-PANX1雙表達載體，其特征在于：含有如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的P2X₇-PANX1雙表達載體，其特征在于：含有如SEQ?ID?NO.17、SEQ?ID?NO.18所示的核苷酸序列。

3.一種如權(quán)利要求1或2所述的P2X₇-PANX1雙表達載體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）利用PCR擴增P2X₇基因，將擴增產(chǎn)物連接到pEGFP-N1載體上，獲得陽性重組質(zhì)粒pP2X₇-EGFP，擴增P2X₇基因的引物序列如SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示；

（2）利用PCR擴增PANX1基因，將擴增產(chǎn)物連接到pDsRed-N1載體上，獲得陽性重組質(zhì)粒pPANX1-RFP，擴增PANX1基因的引物序列如SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6所示；

（3）利用PCR擴增pPANX1-RFP質(zhì)粒上CMV:PANX1-dsRED-Plo_yA完整調(diào)控框架，利用PCR反向擴增pP2X₇-EGFP質(zhì)粒骨架，兩種擴增產(chǎn)物混合后直接轉(zhuǎn)化宿主菌，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒，鑒定即得P2X₇-PANX1雙表達載體，用于pPANX1-RFP質(zhì)粒的引物序列如SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.8所示，用于pP2X₇-GFP質(zhì)粒的引物序列如SEQ?ID?NO.9、SEQ?ID?NO.10所示。

4.一種轉(zhuǎn)染如權(quán)利要求1或2所述的P2X₇-PANX1雙表達載體的穩(wěn)定系細胞，其特征在于：制備方法包括如下步驟：

（1）取pP2X₇-PANX1雙表達載體轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)備用；

（2）利用G418誘殺細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆，再擴大培養(yǎng)即得。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩(wěn)定系細胞，其特征在于：所述步驟（1）中轉(zhuǎn)染的方法為：取pP2X₇-PANX1質(zhì)粒DNA，與x-fect?polymer及x-fect緩沖液混合，靜置后再與DMEM培養(yǎng)基混勻；取混合物作為細胞培養(yǎng)液，于37℃、二氧化碳氣氛中培養(yǎng)細胞2～3天。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩(wěn)定系細胞，其特征在于：所述步驟（2）中G418的濃度為600μg/ml細胞培養(yǎng)基。

7.一種如權(quán)利要求4-6任一項所述的轉(zhuǎn)染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩(wěn)定系細胞的應(yīng)用，其特征在于：穩(wěn)定系細胞作為嘌呤能死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡研究模型或死亡膜孔形成機制研究模型中的應(yīng)用。

8.一種如權(quán)利要求4-6任一項所述的轉(zhuǎn)染P2X₇-PANX1雙表達載體的穩(wěn)定系細胞的應(yīng)用，其特征在于：穩(wěn)定系細胞作為抑制嘌呤能死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡的藥物篩選中的應(yīng)用。