[發明專利]熒光標記的原位再活化

有效

• 申請號: 201410055087.2
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103994987B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: A.P.J.M.波特曼;C.J.扎奇列森
• 申請（專利權）人: FEI公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/76
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 馬紅梅;徐紅燕

在樣本表面處局部地提供蒸氣以允許熒光標記在真空室內發熒光。例如，納米毛細管可以在相關區域附近分配液體，該液體蒸發來增加熒光標記附近的蒸氣壓強。熒光標記處的蒸氣壓強的增加優選地足夠大以防止去活化或者使熒光標記再活化，同時真空室內的總壓強優選地足夠低以允許帶電粒子束在極少或沒有附加排空抽吸的情況下操作。

發明技術領域

本發明涉及在降低后的壓強條件下的熒光標記的再活化。

發明背景

生物系統是極其復雜的。理解它們需要明白結構、功能與不同分辨率水平下的定位之間的詳細關系的能力。一種相關的方法（其使用了光學顯微術和電子顯微術兩者）產生最全面的結果。例如，光顯微術信息可以用來識別樣本中生物上重要的區域及其動態，電子顯微術可以在固定和/或著色后用來分解那些區域內的結構細節。

一種用于研究細胞結構、分子動態和運動性的已經獲得廣泛接受的有力技術是應用重組基因技術將“報告（reporter）”基因鏈接到“相關基因（genes of interest）”（GoI）。因此，當在正常基因轉錄/翻譯過程中表達的具體GoI時，還將表達報告基因，從而產生小的、可檢測蛋白，該蛋白以附著到由該GoI針對其編碼的“相關蛋白（protein ofinterest）”（PoI）上而結束。

被廣泛接受的報告基因在與針對綠色熒光蛋白（GFP）而進行編碼，可在野生型和轉基因版中獲得這些報告基因，并且所表達的GFP具有在發射波長在從藍色擴展到紅色的熒光。GFP相對小（29.6 kDa，直徑3 nm，長4 nm），并且其色基在內部受到良好保護并且不需要任何針對光發射的輔助因子。在生物學環境下，“照亮（light up）”GFP所需的全部是在適當波長下通過激光的照明用于GFP激勵和熒光衰減。

清楚地，如果可以在細胞內精確地確定GFP的X-Y-Z位置（例如，精度達10 nm）,則對PoI的位置了解將達到相似的精度。可以通過光顯微鏡觀察到發熒光的GFP，并且從而可以相對于樣本中可觀察到的結構而看到PoI的位置。盡管不能用來看熒光，但電子顯微鏡可以用來在比光顯微鏡中可能實現的高得多的放大率下形成結構的圖像。針對從各種熒光標記（如GFP、染料和量子點）獲得高位置信息，已經建議并且在一些情況下證實了現有技術中的若干種技術。在一種技術（Buijsse等人的被轉讓給本申請的受讓人的美國專利號為7,317,515的通過引用結合于此的題為“定位熒光標記的方法（Method of LocalizingFluorescent Markers）”中建議了這種技術，帶電粒子束將對樣本的表面進行掃描，當該束碰撞熒光標記時，會對標記造成破壞并且使熒光熄滅。然后，當熒光熄滅時，熒光標記的位置將對應于帶電粒子束的位置。因為帶電粒子束可以被聚焦成一個比照亮標記的激光小得多的點，并且將以高精度確定帶電粒子束在其掃描過程中的任何時間時的位置，所以將以相似的精度確定熒光標記的位置和因此PoI的位置。

發明概述

因此，本發明的目標是在真空室中使用熒光標記改進結構的成像。

申請人已經發現當暴露在低壓強（次大氣壓）環境下時熒光標記停止發熒光，并且當將熒光標記帶回較高壓強下時恢復熒光。

本發明的實施例在樣本表面處局部地提供了蒸氣以允許熒光標記在真空室內發熒光。例如，納米毛細管可以在相關區域附近分配液體，該液體蒸發來增加熒光標記附近的蒸氣壓強。熒光標記處的蒸氣壓強的增加優選地足夠大以防止去活化或者使熒光標記再活化，同時真空室內的總壓強優選地足夠低以允許帶電粒子束在極少或沒有附加排空泵送的情況下操作。

為了可以更好地理解以下本發明的詳細說明，上文已經相當廣泛地概述了本發明的特征和技術優點。下文將描述本發明的附加特征和優點。本領域技術人員應認識到所披露的概念和具體實施例可容易地用作改進或設計用于實施本發明相同目的其他結構的基礎。本領域的技術人員還應認識到這些同等構造不脫離如所附權利要求中所闡明的本發明的精神和范圍。

附圖簡要說明