[發(fā)明專利]一種血液中亞硝酸鹽的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410054811.X
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103760121B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊亞玲;趙嬌;寧金艷;王軍;呂云輝
• 申請（專利權(quán)）人: 云南健牛生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于體內(nèi)藥物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種血液亞硝酸鹽的檢測方法。

背景技術(shù)

一氧化氮（NO）是一種對心血管、內(nèi)分泌、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)起調(diào)控作用生物信號分子，發(fā)展一種血液及體液中NO簡單、準確的檢測方法對其在臨床、藥物中的作用是非常重要的。NO具有結(jié)構(gòu)簡單、低分子量、高親脂性及自由基等特點，在體內(nèi)極不穩(wěn)定，有很短半衰期，僅有幾秒鐘，易形成亞硝酸鹽和硝酸鹽。直接進行NO檢測是困難的，作為相對穩(wěn)定的NO代謝產(chǎn)物，亞硝酸鹽（NO₂^-）在最近10年成為世界醫(yī)學(xué)界的熱點，通過測定血液及體液中的NO₂^-的含量來反映體內(nèi)NO含量和作為反應(yīng)多項身體機能的重要指標或疾病診斷。

目前亞硝酸鹽檢測亞硝酸鹽的測定方法有離子色譜法、分光光度法、熒光光度法、高效液相色譜法等。食品中亞硝酸鹽一是含量相對高，二是基本沒有鹽的干擾，離子色譜法及光度法都是較適合的檢測方法，而體內(nèi)血液或體液中亞硝酸鹽含量低，樣品量少，基體干擾嚴重。目前檢測通常用Griess檢測試劑盒，由于受到檢測靈敏度的限制及基體干擾，通常很難檢測出血液或體液中亞硝酸鹽，其靈敏度通常只能達到1μg/mg。研究小組之前已利用高效液相色譜(HPLC)對血液尿液及組織中硝酸鹽與亞硝酸鹽檢測進行了研究，取得了不錯的效果，申請了發(fā)明專利（201310129291.X），同時還將亞硝酸鹽與Griess試劑反應(yīng)，經(jīng)濁點萃取（CPE）進行分離、富集，直接目視比色，進行血液尿液中亞硝酸鹽簡單、快速檢測，申請了發(fā)明專利（201310274145.6、201310428467.1）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，臨床上更需要一種能定量、準確、方便的檢測血液中亞硝酸鹽方法，由于臨床上血液亞硝酸鹽檢測具有樣品量少、基體干擾大，樣本量大等特點，若用現(xiàn)行的光度法檢測需要較多樣品量，否則要進一步稀釋，降低檢測靈敏度。本發(fā)明利用酶標儀替代通用的光度計，一是檢測波長通用，一般酶標儀都具此波長；二是檢測所需量少，只需200微升；三是檢測量大，可以同時檢測98個樣本，檢測效率高等特點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡單快速、靈敏度高、能大批量、定量檢測血液中亞硝酸鹽的方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。

除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。

一種血液中亞硝酸鹽的檢測方法，包括以下步驟：

（1）亞硝酸鹽標準工作曲線的制作

①基體空白溶液的制備：取10 mL不含亞硝酸鹽的新鮮加抗凝劑血液，放入離心機中離心，取上清液5 mL，加入由0.2mol/L氫氧化鈉溶液1 mL和硫酸鋅1 g組成的蛋白沉淀脫色劑, 混合均勻1min，離心分離，取出上清液， 得到幾乎無色、透明的基體空白溶液。

②分別取濃度為1.0 μg/mL 的NO₂^- 20、40、60、80、100μL標準溶液于微量試管中，用步驟①制備好的基體溶液稀釋至500μL，加入GriessA試劑25μL，混合均勻；1min后加入GriessB試劑25μL，混合均勻。取200μL混勻顯色液于酶標板中，在酶標儀波長490nm處測定吸光度，制作工作曲線，得到亞硝酸鹽的檢測限和線性回歸方程；

（2）樣品測定

血液的檢測：取5 mL新鮮加抗凝劑血液，放入離心機中離心，取上清液2 mL，加入由0.2mol/L氫氧化鈉溶液0.4mL和硫酸鋅0.4g組成的蛋白沉淀脫色劑, 渦旋混合均勻1min，離心分離，取500μL上清液微量試管中,加入GriessA試劑25μL，混合均勻；1min后加入GriessB試劑25μL，混合均勻。取200μL混勻顯色液于酶標板中，在酶標儀波長490nm處測定吸光度，并對照步驟（1）所得的線性回歸方程，計算出樣品中亞硝酸鹽的含量。

其中，步驟（1）（2）中所述的GriessA試劑為50mg對氨基苯磺酸溶于5mL鹽酸（0.5mol/L）；GriessB試劑為4mg 1-萘胺 溶于4mL甲醇（50%）；

所述的離心條件為離心時間5～10min，離心速率3000～6000r／min。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點:

1、利用酶標儀替代通用的光度計，檢測波長定為幾乎所有酶標儀都配的490nm處，檢測所需量少，只需200微升，可以同時檢測98個樣本，檢測效率高。