[發(fā)明專利]酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410053650.2
• 申請(qǐng)日: 2014-02-18
• 公開（公告）號(hào): CN103820404A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂鳳霞;陸兆新;郭芳芳;張充;別小妹;趙海珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體及制備方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

脂肪氧合酶（Lipoxygenase,?EC?1.13.11.12,?LOX）廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，在藻類、面包酵母、真菌以及氰細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)它的存在。LOX能專一性催化含1,4-順，順-戊二烯雙鍵體系的多不飽和脂肪酸氧化形成具有共軛雙鍵的氫過氧化物，這些氫過氧化物性質(zhì)活潑，是重要的化學(xué)反應(yīng)中間體，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，尤其在食品加工中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，如面粉及其制品品質(zhì)改良、制備風(fēng)味化合物、茶葉加工等。盡管人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到LOX在食品加工中的潛在應(yīng)用價(jià)值，且LOX在自然界中廣泛存在，但從自然界中直接獲得不僅得率低而且純化難，獲得LOX純酶的成本很高。因此，通過基因工程菌高效表達(dá)，且又經(jīng)過簡(jiǎn)單的純化過程獲得高純度的LOX可以解決上述問題，但微生物脂肪氧合酶自身存在催化活性低、熱穩(wěn)定性較差的缺陷，限制其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)脂肪氧合酶進(jìn)行分子改造，以期獲得酶學(xué)性質(zhì)更適用工業(yè)應(yīng)用的突變酶具有重要的意義。

目前，酶分子改造的策略主要有非理性設(shè)計(jì)（定向進(jìn)化）與理性設(shè)計(jì)的策略。通過理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化改善酶學(xué)性質(zhì)一直是蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。而定向進(jìn)化技術(shù)是改善蛋白質(zhì)性質(zhì)最有效的策略之一，是在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選），能在短期內(nèi)獲得具有優(yōu)良性質(zhì)的突變酶。經(jīng)檢索未見脂肪氧合酶分子定向進(jìn)化研究的相關(guān)文獻(xiàn)和專利報(bào)道。

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發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是為了克服以上現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體及制備方法。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體，其氨基酸殘基序列如SEQ?ID?NO.1所示，其在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，即第305位氨基酸由天冬酰胺替換成了天冬氨酸。

一種以上所述的酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，包含如下步驟：

（1）脂肪氧合酶高通量篩選：測(cè)定酶活時(shí)重組脂肪氧合酶基因工程菌的破碎條件為溶菌酶添加量1.5?mg/mL、溶菌酶處理時(shí)間40?min、EDTA-2Na添加量2.0?mmol/L、吐溫-60添加量2%、－70℃冷凍37℃融解、凍融3次；?

（2）易錯(cuò)PCR：以野生型魚腥藻脂肪氧合酶質(zhì)粒pET-32a-ana-LOX為模板，上游引物為5^’-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3^’，下游引物為5^’-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3^’，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增；易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后，限制性內(nèi)切酶XhoI和SacI分別對(duì)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-32a?(+)進(jìn)行消化、連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100?μg/mL的氨芐青霉素LB平板，于37℃培養(yǎng)12?h后，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行陽性克隆子鑒定，挑選突變子轉(zhuǎn)移至96孔板中誘導(dǎo)表達(dá)，并基于96微孔板高通量篩選模型對(duì)突變子進(jìn)行篩選并測(cè)序，再經(jīng)過搖瓶復(fù)篩，得到突變子；

（3）DNA?Shuffling：采用步驟（2）得到的突變子基因?yàn)橛H本基因，通過DNaseI將親本基因隨機(jī)片段化并獲取50-100?bp的基因片段，進(jìn)行無引物PCR，組裝形成大片段，最后在親本基因擴(kuò)增引物的條件下，擴(kuò)增出改組基因庫；對(duì)改組基因庫進(jìn)行XhoI和SacI酶切，并與表達(dá)載體pET-32a?(+)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E.?coli?BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100?μg/mL的氨芐青霉素的平板，于37℃培養(yǎng)12?h后，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選與鑒定，挑選突變子轉(zhuǎn)移至96孔板中誘導(dǎo)表達(dá)，并基于96微孔板高通量篩選模型對(duì)突變子進(jìn)行篩選并測(cè)序，再經(jīng)過搖瓶復(fù)篩，獲得酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體；

（4）將步驟（3）得到的脂肪氧合酶突變體的工程菌表達(dá)與純化。

所述的酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，步驟（1）中測(cè)定酶活的方法可以為碘化鉀-淀粉法。