[發明專利]酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體及制備方法

有效

• 申請號: 201410053650.2
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103820404A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 呂鳳霞;陸兆新;郭芳芳;張充;別小妹;趙海珍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

1.酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體，其特征在于，其氨基酸殘基序列如SEQ?ID?NO.1所示，其在一個氨基酸位點發生突變，即第305位氨基酸由天冬酰胺替換成了天冬氨酸。

2.一種權利要求1所述的酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，包含如下步驟：

（1）脂肪氧合酶高通量篩選：測定酶活時重組脂肪氧合酶基因工程菌的破碎條件為溶菌酶添加量1.5?mg/mL、溶菌酶處理時間40?min、EDTA-2Na添加量2.0?mmol/L、吐溫-60添加量2%、－70℃冷凍37℃融解、凍融3次；?

（2）易錯PCR：以野生型魚腥藻脂肪氧合酶質粒pET-32a-ana-LOX為模板，上游引物為5^’-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3^’，下游引物為5^’-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3^’，進行易錯PCR擴增；易錯PCR擴增產物經膠回收試劑盒回收后，限制性內切酶XhoI和SacI分別對易錯PCR擴增產物和質粒pET-32a?(+)進行消化、連接，轉化至感受態細胞，涂布于含100?μg/mL的氨芐青霉素LB平板，于37℃培養12?h后，對轉化子進行陽性克隆子鑒定，挑選突變子轉移至96孔板中誘導表達，并基于96微孔板高通量篩選模型對突變子進行篩選并測序，再經過搖瓶復篩，得到突變子；

（3）DNA?Shuffling：采用步驟（2）得到的突變子基因為親本基因，通過DNaseI將親本基因隨機片段化并獲取50-100?bp的基因片段，進行無引物PCR，組裝形成大片段，最后在親本基因擴增引物的條件下，擴增出改組基因庫；對改組基因庫進行XhoI和SacI酶切，并與表達載體pET-32a?(+)進行連接，轉化至E.?coli?BL21感受態細胞，涂布于含100?μg/mL的氨芐青霉素的平板，于37℃培養12?h后，對轉化子進行篩選與鑒定，挑選突變子轉移至96孔板中誘導表達，并基于96微孔板高通量篩選模型對突變子進行篩選并測序，再經過搖瓶復篩，獲得酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體；

（4）將步驟（3）得到的脂肪氧合酶突變體的工程菌表達與純化。

3.根據權利要求2所述的酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（1）中測定酶活的方法為碘化鉀-淀粉法。

4.根據權利要求2所述的酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（2）中易錯PCR的條件為：改變PCR的反應體系：Mn²⁺濃度為0.01-0.4?mmol/L，Mg²⁺濃度為0.625-2.5?mmol/L，dNTP濃度為0.125-0.25?mmol/L，PCR反應條件：95°C?5?min；然后?95°C?30?sec，55°C?1?min，72°C?10?min，共30個循環；最后72°C?10?min。

5.根據權利要求2所述的酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（2）中感受態細胞為E.?coli?BL21。

6.根據權利要求2所述的酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（4）中脂肪氧合酶突變體的工程菌表達與純化方法為將含有脂肪氧合酶突變體的工程菌接種于含有100?μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃，180?rpm培養14?h；接種量體積比為2%，加入上述LB液體培養基中，37℃，180?rpm?培養至OD₆₀₀為0.6-0.8時，加IPTG至100?μg/mL，低溫16℃誘導16?h，9000?rpm離心20?min，收集菌體，用磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，檢測上清液酶活，并將上清液過Ni-NTA親和柱純化，透析過夜即可得到純的脂肪氧合酶突變體，其中磷酸緩沖液組成為50?mM?PBS與0.3M?NaCl以及質量體積比為0.5％Triton?X-100的混合液。