[發(fā)明專利]酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410053650.2
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103820404A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂鳳霞;陸兆新;郭芳芳;張充;別小妹;趙海珍
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

1.酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體，其特征在于，其氨基酸殘基序列如SEQ?ID?NO.1所示，其在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，即第305位氨基酸由天冬酰胺替換成了天冬氨酸。

2.一種權(quán)利要求1所述的酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，包含如下步驟：

（1）脂肪氧合酶高通量篩選：測定酶活時(shí)重組脂肪氧合酶基因工程菌的破碎條件為溶菌酶添加量1.5?mg/mL、溶菌酶處理時(shí)間40?min、EDTA-2Na添加量2.0?mmol/L、吐溫-60添加量2%、－70℃冷凍37℃融解、凍融3次；?

（2）易錯(cuò)PCR：以野生型魚腥藻脂肪氧合酶質(zhì)粒pET-32a-ana-LOX為模板，上游引物為5^’-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3^’，下游引物為5^’-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3^’，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增；易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后，限制性內(nèi)切酶XhoI和SacI分別對易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-32a?(+)進(jìn)行消化、連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100?μg/mL的氨芐青霉素LB平板，于37℃培養(yǎng)12?h后，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行陽性克隆子鑒定，挑選突變子轉(zhuǎn)移至96孔板中誘導(dǎo)表達(dá)，并基于96微孔板高通量篩選模型對突變子進(jìn)行篩選并測序，再經(jīng)過搖瓶復(fù)篩，得到突變子；

（3）DNA?Shuffling：采用步驟（2）得到的突變子基因?yàn)橛H本基因，通過DNaseI將親本基因隨機(jī)片段化并獲取50-100?bp的基因片段，進(jìn)行無引物PCR，組裝形成大片段，最后在親本基因擴(kuò)增引物的條件下，擴(kuò)增出改組基因庫；對改組基因庫進(jìn)行XhoI和SacI酶切，并與表達(dá)載體pET-32a?(+)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E.?coli?BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100?μg/mL的氨芐青霉素的平板，于37℃培養(yǎng)12?h后，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選與鑒定，挑選突變子轉(zhuǎn)移至96孔板中誘導(dǎo)表達(dá)，并基于96微孔板高通量篩選模型對突變子進(jìn)行篩選并測序，再經(jīng)過搖瓶復(fù)篩，獲得酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體；

（4）將步驟（3）得到的脂肪氧合酶突變體的工程菌表達(dá)與純化。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（1）中測定酶活的方法為碘化鉀-淀粉法。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（2）中易錯(cuò)PCR的條件為：改變PCR的反應(yīng)體系：Mn²⁺濃度為0.01-0.4?mmol/L，Mg²⁺濃度為0.625-2.5?mmol/L，dNTP濃度為0.125-0.25?mmol/L，PCR反應(yīng)條件：95°C?5?min；然后?95°C?30?sec，55°C?1?min，72°C?10?min，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C?10?min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（2）中感受態(tài)細(xì)胞為E.?coli?BL21。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（4）中脂肪氧合酶突變體的工程菌表達(dá)與純化方法為將含有脂肪氧合酶突變體的工程菌接種于含有100?μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180?rpm培養(yǎng)14?h；接種量體積比為2%，加入上述LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180?rpm?培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)，加IPTG至100?μg/mL，低溫16℃誘導(dǎo)16?h，9000?rpm離心20?min，收集菌體，用磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，檢測上清液酶活，并將上清液過Ni-NTA親和柱純化，透析過夜即可得到純的脂肪氧合酶突變體，其中磷酸緩沖液組成為50?mM?PBS與0.3M?NaCl以及質(zhì)量體積比為0.5％Triton?X-100的混合液。