[發明專利]原癌基因HRAS啟動子甲基化模式與膀胱癌的臨床相關性研究方法

在審

• 申請號: 201410053385.8
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103805705A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 孫曉鳳;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種原癌基因HRAS啟動子甲基化模式與膀胱癌的臨床相關性研究方法，屬于生物基因技術領域。

背景技術

HRAS基因編碼21kDa的蛋白，又稱P21。該基因主要參與調節細胞生長，分裂和細胞凋亡的。通過信號轉導，H-Ras蛋白可以將信號從細胞外轉導到細胞核，指導細胞生長或細胞分裂。HRAS屬于Ras原癌基因家族。原癌基因的突變，具有使正常細胞癌變的潛能。鑒于越來越多的證據顯示：癌基因啟動子區CpG異常的甲基化可能導致癌癥，我們想了解HRAS啟動子區甲基化狀態和膀胱癌之間的關系。

發明內容

本發明的目的在于提供一種原癌基因HRAS啟動子甲基化模式與膀胱癌的臨床相關性研究方法，為了以便能夠研究HRAS基因轉錄調控區(TRR)的甲基化模式，可以進一步被用來作為癌癥生物標志在膀胱癌的早期診斷和早期治療中發揮重要作用。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。

一種原癌基因HRAS啟動子甲基化模式與膀胱癌的臨床相關性研究方法，其具體過程為：

(1)獲得組織標本：所有組織標本來自第三軍醫大學大坪醫院。2008年通過外科手術從患者體內獲得組織樣品，樣品經過病理分析最終確定的15人為膀胱癌患者的組織標本，5人通過病理學分析后證實為非癌變的組織作為正常對照。所有癌組織標本均為確定為移行細胞癌和WHO?II級(中度分化的)。被切除后的腫瘤標本和正常對照組織樣品預先放在液氮中。并對患者的臨床特征進行了記錄，包括性別，發病年齡，臨床分期，淋巴結轉移和組織學分級的等。

(2)篩選轉錄因子結合位點和CpG島：HRASTRRCpG島通過在線工具(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html)分析，采用默認設置(window：100；step：1；observedtoexpectedratioofCplusG：0.6；minimumaveragepercentageofGplusC：50；minimumlengthofreportedCpGisland：200bp)分析，并在線設計引物(http：//www.urogene.org/methprimer/indexl.html)使用默認設置(window：100；shift：1；Obx/Exp：0.6；GC％：50％)。轉錄因子預測通過在線工具(http：//www.cbrc.jp/htbin/NPH-TFSEARCH)進行了證實。最終確定了-412to-91bp共322bp的序列進行亞硫酸氫鹽測序擴增，共含28個CpG位點。

(3)基因組DNA的提取和基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾：基因組DNA使用微量DNA抽提試劑盒(天根，北京)抽提，按照說明書所介紹步驟進行。簡言之，用蛋白酶K消化后，從組織裂解釋放的核酸被吸附在硅膠柱上，并利用高速離心機將裂解物通過吸附柱。5～8個洗滌周期后，DNA被溶解到洗脫液中，并收集在一個干凈的1.5ml收集管中。分離的DNA用亞硫酸氫鈉修飾，所用試劑盒為修DNA甲基化修飾試劑盒(Epigentek公司，美國)。簡要的操作步驟如下，lugDNA用NaOH變性，在55度條件下，用亞硫酸氫鈉處理8小時，修飾過的DNA懸浮于20ul去離子水中立即使用或-80度存儲。

(4)亞硫酸氫鹽測序(BSP)的PCR和DNA測序：通過PCR擴增重亞硫酸鹽處理的DNA，反應用特異性引物如下：HRASF：5-AGTTTTTTGTGGTTGAAAGATG-3；HRASR：5-CAACCCTCAAAAACAAAACTAA-3。PCR條件如下：94℃變性5分鐘，35個循環的95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，72℃延伸5分鐘。將PCR產物通過電泳在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上分離，然后利用凝膠回收試劑盒進行回收(Promega，美國)。純化的PCR產物，連接到PMD19-T載體(TaKaRa公司，大連)。通過氨芐青霉素篩選后再進行PCR驗證。隨機挑選8個陽性克隆進行DNA測序，測序公司為南京金斯瑞科技公司。

(5)統計分析：甲基化的比例用甲基化的CpG數除以總的CpG數獲得，差異性分析采用非配對t檢驗分析。