[發明專利]原癌基因HRAS啟動子甲基化模式與膀胱癌的臨床相關性研究方法

在審

• 申請號: 201410053385.8
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103805705A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 孫曉鳳;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種原癌基因HRAS啟動子甲基化模式與膀胱癌的臨床相關性研究方法，其特征在于：具體過程為：

(1)獲得組織標本：所有組織標本來自第三軍醫大學大坪醫院，通過外科手術從患者體內獲得組織樣品，樣品經過病理分析最終確定的15人為膀胱癌患者的組織標本，5人通過病理學分析后證實為非癌變的組織作為正常對照，所有癌組織標本均為確定為移行細胞癌和WHOII級(中度分化的)，被切除后的腫瘤標本和正常對照組織樣品預先放在液氮中，并對患者的臨床特征進行了記錄，包括性別，發病年齡，臨床分期，淋巴結轉移和組織學分級的等；

(2)篩選轉錄因子結合位點和CpG島：HRASTRRCpG島通過在線工具(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html)分析，采用默認設置(window：100；step：l；observedtoexpectedratioofCplusG：0.6；minimumaveragepercentageofGplusC：50；minimumlengthofreportedCpGisland：200bp)分析，并在線設計引物(http：//www.urogene.org/methprimer/indexl.html)使用默認設置(window：100；shift：1；Obx/Exp：0.6；GC％：50％)；轉錄因子預測通過在線工具(http：//www.cbrc.jp/htbin/NPH-TFSEARCH)進行證實，最終確定了-412to-91bp共322bp的序列進行亞硫酸氫鹽測序擴增，共含28個CpG位點；

(3)基因組DNA的提取和基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾：基因組DNA使用微量DNA抽提試劑盒抽提，按照說明書所介紹步驟進行，用蛋白酶K消化后，從組織裂解釋放的核酸被吸附在硅膠柱上，并利用高速離心機將裂解物通過吸附柱，5～8個洗滌周期后，DNA被溶解到洗脫液中，并收集在一個干凈的1.5ml收集管中；分離的DNA用亞硫酸氫鈉修飾，所用試劑盒為修DNA甲基化修飾試劑盒；簡要的操作步驟如下，lugDNA用NaOH變性，在55度條件下，用亞硫酸氫鈉處理8小時，修飾過的DNA懸浮于20ul去離子水中立即使用或-80度存儲；

(4)亞硫酸氫鹽測序(BSP)的PCR和DNA測序：通過PCR擴增重亞硫酸鹽處理的DNA，反應用特異性引物如下：HRASF：5-AGTTTTTTGTGGTTGAAAGATG-3；HRASR：5-CAACCCTCAAAAACAAAACTAA-3；PCR條件如下：94℃變性5分鐘，35個循環的95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，72℃延伸5分鐘；將PCR產物通過電泳在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上分離，然后利用凝膠回收試劑盒進行回收；純化的PCR產物，連接到PMD19-T載體；通過氨芐青霉素篩選后再進行PCR驗證；隨機挑選8個陽性克隆進行DNA測序；

(5)統計分析：甲基化的比例用甲基化的CpG數除以總的CpG數獲得，差異性分析采用非配對t檢驗分析。