[發明專利]一種絲狀真菌分生孢子PCR方法

無效

• 申請號: 201410053235.7
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103789439A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 杜克久;宋歌;崔菲;李燕玲
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種絲狀真菌分生孢子PCR方法。

背景技術

絲狀真菌是真菌中一大類群，通常指菌絲體發達但不形成大型子實體的真菌，在工業、農業、醫藥以及基礎生物學研究中具有重要的作用。建立快速科學準確的絲狀真菌鑒定方法是人、動物以及植物病原菌診斷，食品加工、工業發酵、農業堆肥以及污染環境的生物修復等相關研究的基礎。

菌落PCR技術因為其快速、準確而被廣泛應用微生物鑒定以及微生物的DNA分析。D.Gussow和T.Clackson首先利用細菌菌落或菌斑建立了菌落PCR技術，他們利用培養的菌斑或菌落只進行簡單的熱處理或不經任何處理直接用于PCR反應。

真菌菌落PCR技術同樣是利用培養的真菌細胞直接進行PCR反應。除酵母、白色念珠菌等單細胞真菌的菌落PCR外，前人多將菌絲體為試驗材料，以經熱處理或凍融交替處理使菌絲體細胞破壁釋放的DNA為模版進行絲狀真菌的菌落PCR反應(G.Luo?et?a.，2002;A.Carvalho?et?al.,2007;H.Mirhendi?et?al.，2007)。以絲狀真菌菌絲體作為PCR反應試驗材料，在試驗操作中存在刮取菌絲體以及定量困難等問題，導致絲狀真菌菌落PCR穩定性和重復性降低，并由此限制了絲狀真菌菌落PCR的廣泛應用。利用絲狀真菌分生孢子直接進行菌落PCR，試驗操作簡單方便、定量容易，可以很好地解決絲狀真菌菌絲體PCR中出現的問題。

絲狀真菌分生孢子PCR關鍵是PCR反應體系中用于擴增的分生孢子有效數量，即直接影響PCR反應穩定性和重現性的分生孢子最低數量和最高數量。有關方面僅見于鐮孢菌菌落PCR反應中關于其最低檢出限的簡要報道(A.Lau?et?al.，2008)，在其他絲狀真菌以及絲狀真菌PCR反應體系所能允許的最高分生孢子數量方面，國內外均未見報道。

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種絲狀真菌分生孢子PCR方法。其具體技術方案為：

一種絲狀真菌分生孢子PCR方法，包括以下步驟：

(1)將絲狀真菌接種于培養基上進行培養；

(2)絲狀真菌培養物在培養基上長出肉眼可見分生孢子，制備分生孢子懸浮液，用于PCR擴增；

(3)1～1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

進一步優選，步驟(1)中所述培養基采用PDA培養基，培養溫度為28℃。

進一步優選，步驟(2)中所述分生孢子懸浮液的制備方法為，絲狀真菌在培養基上長出肉眼可見分生孢子，用無菌牙簽或無菌接種環收集分生孢子，將收集到的分生孢子轉入含有無菌水的1.5ml的離心管中，震蕩制成分生孢子懸浮液，用血球計數板計數。

進一步優選，步驟(2)絲狀真菌分生孢子PCR反應體系包括1_×PCR緩沖液，0.2mM?dNTP混合物，1μM的上下游引物，0.4mM?MgCl₂，絲狀真菌分生孢子有效濃度為10⁵～10⁸CFU/ml，TaqDNA聚合酶2U，無菌水補齊至50μl，進行PCR反應。

進一步優選，步驟(2)中絲狀真菌中黑曲霉分生孢子PCR擴增反應體系對其中分生孢子濃度要求嚴格，體系中黑曲霉分生孢子濃度大于10⁸CFU/ml時，則不能擴增，其分生孢子有效濃度為10⁵～10⁸CFU/ml，最適宜濃度為10⁷CFU/ml，此分生孢子有效濃度范圍以及最適濃度適合于其它絲狀菌絲分生孢子PCR反應體系對分生孢子濃度要求。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明確定了絲狀真菌分生孢子PCR擴增的有效孢子濃度為10⁵～10⁸CFU/ml，最適宜孢子濃度為10⁷CFU/ml，解決了絲狀真菌菌落PCR反應低穩定性和低重復性的實際應用問題，可直接應用于臨床、工農業以及環境等領域絲狀真菌的快速鑒定。

附圖說明