[發明專利]一種分離純化背根神經元的方法

無效

• 申請號: 201410052309.5
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103789264A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 劉睿;許漢鵬;茍玲
• 申請（專利權）人: 劉睿
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 陜西增瑞律師事務所 61219
• 代理人: 張瑞琪

技術領域

本發明屬于細胞分離技術領域，具體涉及一種分離純化背根神經元的方法。

背景技術

在體外進行神經元細胞研究時，非神經元細胞常常會造成嚴重的干擾。背根神經元易于識別，能很容易地與非神經元細胞區分，被廣泛應用于神經元細胞的體外研究，如用于研究神經元軸突生長、髓鞘形成等。眾多研究表明哺乳動物的背根神經元細胞能夠再體外生存并且能夠再生。如何分離得到純度較高、功能不受影響的背根神經元顯得尤為重要。

目前，分離純化背根神經元的方法為抗有絲分裂試劑，如氟脫氧尿苷等處理共培養體系從而純化背根神經元。然而，這種方法存在的缺點是：需要使用抗有絲分裂試劑多次重復處理細胞（通常3次以上），通常需要兩周時間才能獲得純度較高的細胞，費時費力，而且這種長時間的純化過程增加了被細菌污染的幾率。

發明內容

本發明的目的是提供一種分離純化背根神經元的方法，采用該分離純化方法減少了純化背根神經元的步驟，縮短了純化背根神經元所需的時間。

本發明所采用的技術方案是，一種分離純化背根神經元的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一、細胞混合液的制備：

切取大鼠胚胎的背根神經節放入培養基中進行培養；將得到的背根神經節放入培養皿中，然后加入質量濃度為0.03%～0.15%的胰酶/EDTA溶液進行消化，消化時間為10min～30min，消化后得到細胞混合液；

步驟二、細胞懸浮液的制備：

收集步驟一中所得的細胞混合液中的細胞，向其中加入含胎牛血清和DNA酶的培養基，然后將其吹散，并將吹散后的細胞用細胞過濾器進行過濾，采用神經元基礎培養液洗滌過濾后的細胞，得到細胞懸浮液；

步驟三、對細胞懸浮液進行純化，得到背根神經節神經元：

將多熔素和層粘連蛋白包被的蓋玻片放入細胞培養板中，再向每孔中加入步驟二中得到的細胞懸浮液，第一次細胞培養18h～26h后，然后加入N-乙基順丁烯二酰亞胺，得到N-乙基順丁烯二酰亞胺的質量濃度為45μg/ml～95μg/ml的混合液，第二次細胞培養68h～75h，用培養基第一次置換1/2～2/3的混合液，然后每間隔46h～50h用培養基進行第二次和第三次置換1/2～2/3的混合液，共換液三次后得背根神經節神經元。

進一步地，該培養基為L15培養基。

進一步地，該步驟一中的胰酶/EDTA溶液的質量濃度為0.05%～0.125%。

進一步地，該步驟二中采用的細胞過濾器的孔徑為40μm。

進一步地，該步驟三中的第一次細胞培養為在溫度為37℃，通有5%CO₂的培養箱中培養時間為20h～24h。

進一步地，該步驟三中的細胞懸浮液中N-乙基順丁烯二酰亞胺的濃度為55μg/ml～90μg/ml。

本發明一種分離純化背根神經元的方法，使用高濃度的N-乙基順丁烯二酰亞胺，使得僅執行一次純化的步驟，即可獲得純度較高的細胞。節省了純化的步驟和時間，也解決了因純化步驟過多以及純化時間過長細胞被污染的問題。

附圖說明

圖1為采用本發明的方法分離純化背根神經元的流程圖；

圖2為采用本發明實施例4的方法得到的背根神經元的純度檢測；其中，A圖為未采用任何試劑處理培養72小時；B圖為未采用任何試劑處理培養7天;C圖為本發明實施例4的方法培養72小時；D圖為本發明實施例4的方法培養7天；

圖3為采用本發明實施例4的方法得到的背根神經元的純度檢測結果示意圖；其中，A、B、C圖為非背根神經元細胞，D圖和E圖為背根神經元細胞，F圖為量化結果；

圖4為采用本發明實施例4的方法得到的背根神經元的生存能力的檢測結果示意圖；

圖5為本發明提供的一種檢測分離純化后的背根神經元的神經突形成能力的結果示意圖；其中，A、B、C、D圖分別為現有傳統方法分離得到的背根神經元細胞第1、3、5、7天時神經突的生長情況；E、F、G、H圖分別為采用本發明實施例4的方法分離得到的背根神經元細胞第1、3、5、7天時神經突的生長情況；I圖為量化比較結果；

圖6為采用本發明實施例3的方法得到的背根神經元的髓鞘形成能力的檢測結果示意圖；其中，其中，A圖為外周蛋白0；B圖為髓鞘堿性蛋白；C圖為A圖和B圖的疊加圖；D圖為Caspr蛋白；E圖為Nav1.6；F圖為D圖和E圖的疊加圖。

具體實施方式