[發明專利]一種分離純化背根神經元的方法

無效

• 申請號: 201410052309.5
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103789264A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 劉睿;許漢鵬;茍玲
• 申請（專利權）人: 劉睿
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 陜西增瑞律師事務所 61219
• 代理人: 張瑞琪

1.一種分離純化背根神經元的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一、細胞混合液的制備：

切取大鼠胚胎的背根神經節放入培養基中進行培養；將得到的背根神經節放入培養皿中，然后加入質量濃度為0.03%～0.15%的胰酶/EDTA溶液進行消化，消化時間為10min～30min，消化后得到細胞混合液；

步驟二、細胞懸浮液的制備：

收集步驟一中所得的細胞混合液中的細胞，向其中加入含胎牛血清和DNA酶的培養基，然后將其吹散，并將吹散后的細胞用細胞過濾器進行過濾，采用神經元基礎培養液洗滌過濾后的細胞，得到細胞懸浮液；

步驟三、對細胞懸浮液進行純化，得到背根神經節神經元：

將多熔素和層粘連蛋白包被的蓋玻片放入細胞培養板中，再向每孔中加入步驟二中得到的細胞懸浮液，第一次細胞培養18h～26h后，然后加入N-乙基順丁烯二酰亞胺，得到N-乙基順丁烯二酰亞胺的質量濃度為45μg/ml～95μg/ml的混合液，第二次細胞培養68h～75h，用培養基第一次置換1/2～2/3的混合液，然后每間隔46h～50h用培養基進行第二次和第三次置換1/2～2/3的混合液，共換液三次后得背根神經節神經元。

2.根據權利要求1所述的一種分離純化背根神經元的方法，其特征在于，所述培養基為L15培養基。

3.根據權利要求1所述的一種分離純化背根神經元的方法，其特征在于，所述步驟一中的胰酶/EDTA溶液的質量濃度為0.05%～0.125%。

4.根據權利要求1所述的一種分離純化背根神經元的方法，其特征在于，所述步驟二中采用的細胞過濾器的孔徑為40μm。

5.根據權利要求1所述的一種分離純化背根神經元的方法，其特征在于，所述步驟三中的第一次細胞培養為在溫度為37℃，通有5%CO₂的培養箱中培養時間為20h～24h。

6.根據權利要求1所述的一種分離純化背根神經元的方法，其特征在于，所述步驟三中的細胞懸浮液中N-乙基順丁烯二酰亞胺的濃度為55μg/ml～90μg/ml。