[發明專利]一種兔病毒性出血癥病毒重組亞單位疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201410052289.1
• 申請日: 2014-02-17
• 公開（公告）號: CN103789274A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 閔慶如;易小萍;范志永;冀海明;王秀梅;張大鶴;宋曉飛;徐龍濤;張連秀;王蕾;禚寶山;鮑海忠
• 申請（專利權）人: 齊魯動物保健品有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/866;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

1.一種桿狀重組病毒，其特征在于：該重組桿狀病毒的轉移載體包括：在pVL1393轉移載體PolyA后的SnaBⅠ酶切位點插入HS4序列，在多克隆位點之前插入蜂毒素信號肽；在多克隆位點中插入一個拷貝的MEV結構蛋白VP2基因；在外源基因的C端含有6個組氨酸的標簽序列，該株病毒被命名為重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒rBac-HBM-HS4-VP60，已于2013年08月02日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC?No.8052。

2.根據權利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于該重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC?No.8052能夠感染Sf9細胞并高效率的分泌表達重組亞單位蛋白VP60，該重組VP60蛋白質在功能上等同于RHDV天然VP60蛋白質，并能夠進一步自組裝成RHDV衣殼蛋白。

3.如權利要求2所述的RHDV衣殼蛋白，其特征在于在SF9細胞中表達量比常規商業化載體pVL1393系列載體的表達量更高，且被分泌到胞外，穩定存在于表達的上清液中，此上清液不需要經純化即能使用。

4.如權利要求2所述的重組RHDV衣殼蛋白，其特征在于該重組RHDV衣殼蛋白在抗原性和免疫源性上與天然的RHDV一樣，并且能夠誘導兔產生針對RHDV感染的免疫應答的一種蛋白。

5.一種用于預防兔病毒性出血癥的病毒重組亞單位疫苗，其特征是：它包含了權利要求2所述的重組RHDV衣殼蛋白和權利要求3所述的表達的上清液。

6.根據權利要求5所述的預防兔病毒性出血癥的病毒重組亞單位疫苗，其特征是：疫苗為肌肉注射劑型，含有獸用生物制品常用到的佐劑。

7.一種兔病毒性出血癥病毒亞單位疫苗的大規模制備方法，包括如下步驟：

（1）利用三角搖瓶無血清全懸浮培養Sf9細胞制備種子細胞；

（2）利用三角搖瓶無血清全懸浮制備表達RHDV亞單位蛋白VP60的重組苜蓿銀粉夜蛾核型多角體病毒CGMCC?No.8052；

（3）將種子細胞直接接種入攪拌式生物反應器全懸浮培養Sf9細胞，將生物反應器的培養規模放大至1噸細胞罐，并通過流加培養工藝將細胞密度培養至2.0×10⁶cells/ml～4.0×10⁶cells/ml；

（4）以感染復數為0.5～5.0接種病毒CGMCC?No.8052，培養72～140h；

（5）收獲上述培養液上清，經滅活、加入氫氧化鋁膠混合后制成疫苗。

8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于全部培養過程，包括細胞凍存和復蘇，均為單細胞全懸浮的、無血清、無蛋白培養環境。

9.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于使用機械攪拌式生物反應器全懸浮培養Sf9細胞，并且最大培養規模達到1噸細胞罐。