[發明專利]一種利用基因組編輯技術實現原位激活基因的表達方法及其應用

有效

• 申請號: 201410051873.5
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN104845994B
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 陳玲玲;楊力;向劍鋒
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/11;C12Q1/6876
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發明涉及一種利用基因組編輯技術實現原位激活基因的表達方法及其應用。本發明通過同源重組技術，在受體的靶基因啟動子之后，靶基因的基因序列之前，插入一個第二啟動子及篩選標記基因，并通過篩選標記篩選獲得陽性結果，從而實現原位激活基因的表達。本發明的表達方法可用于原位激活基因的過表達，從而應用于基因的功能研究領域。

技術領域

本發明涉及基因轉錄調控研究領域，具體涉及一種利用基因組編輯技術實現原位激活基因的表達方法及其應用。

背景技術

基因的表達調控受到多個層次的調控，包括轉錄水平和轉錄后水平，對于編碼基因還包括翻譯水平和翻譯后水平的調控等等。

不同的基因在表達的時候也受到不同形式的調控。在研究基因功能時常通過功能缺失實驗（loss of function）和功能獲得實驗（gain of function）兩種方式來實現對基因功能的研究。其中功能缺失實驗常用的方式有RNA干擾技術（RNAi Interference，RNAi）等技術實現對靶標基因表達的下調，而功能獲得實驗常用的方式利用表達載體表達基因的cDNA序列實現基因產物的過表達。

表達載體是一種可以在原核生物和真核生物細胞中外源表達蛋白或者RNA的一種環形雙鏈DNA分子，被廣泛應用于研究蛋白、RNA等生物大分子在細胞生命活動中的作用。按照應用的宿主不同可分成原核表達載體和真核表達載體。常見的原核表達載體有pET系列、pQE系統、pGEX系列、pMAL系列等多種。而真核表達載體則根據適用的物種不同分酵母表達載體，植物表達載體和真核哺乳動物載體等多種。

在目前的研究中，研究者通常將基因的cDNA序列克隆到表達載體中進行過表達，實現功能過表達。此種方式已用于外源過表達蛋白編碼基因基因和外源表達microRNA等。雖然此種方式已發展成熟，但實際操作過程中經常會遇到很多問題，如不能反內源的應基因表達環境，表達產物不能實現正常定位等等。特別是近年來有關長非編RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）的研究讓人們進一步意識到這種表達方式存在的不足。

長非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一類存在于細胞中，長度大于200nt且不編碼蛋白質產物或者編碼不具有功能的蛋白質產物的RNA分子。已有的研究已發現了多種類型的lncRNAs，且lncRNAs可通過參與染色質重塑，染色質高級結構維持等多種方式參與基因表達調控，同時還可參與細胞核內亞核結構的形成等等。

人們發現用傳統的表達載體進行lncRNAs的過表達時，過表達的RNA往往不能實現正確的亞細胞定位。這有可能是由于過表達cDNA序列時，過表達的RNA無需經過類似于內源基因的RNA加工（RNA processing）過程，如剪接（splicing）；同時表達成熟的lncRNA也與外源表達的蛋白質不同，其分子上可能不具有特殊的細胞內不同位置的定位信號等等。因此，一種類似內源表達的方式實現對靶基因的過表達對于研究lncRNA的功能具有十分重要的作用。

CCAT1-L是一條在結腸癌中高表達的長非編碼RNA。原位雜交實驗結果顯示CCAT1-L分布在細胞核中，呈點狀分布（如圖Fig1A），并聚集在其轉錄位點附近（如圖Fig1B）。功能獲得實驗對于研究CCAT1-L的生物學功能具有十分重要的作用。然而，利用傳統的載體過表達lncRNAs的實驗結果顯示，利用外源載體過表達的CCAT1-L分布在整個細胞中,即在細胞核和細胞漿中都有分布（如圖Fig1C）。這說明傳統方式過表達的CCAT1-L無法模擬內源RNA的定位情況，即無法正確發揮該RNA的生物學功能。利用此種方式過表達CCAT1-L可能導致獲得不正確甚至錯誤的實驗結果。因此，一種可以模擬細胞內源CCAT1-L過表達的實驗方法對于研究其功能具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種利用基因組編輯技術實現原位激活基因的表達系統及其應用，尤其是利用基因組編輯技術實現原位激活長非編碼RNA基因的表達方法及其應用。