[發明專利]一種利用基因組編輯技術實現原位激活基因的表達方法及其應用

有效

• 申請號: 201410051873.5
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN104845994B
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 陳玲玲;楊力;向劍鋒
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/11;C12Q1/6876
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的表達方法，為：通過同源重組技術，在受體的靶基因啟動子之后，靶基因的基因序列之前，插入一個第二啟動子及篩選標記基因，并通過篩選標記篩選獲得陽性結果，所述靶基因為CCAT1-L，所述第二啟動子選自CMV啟動子或EF1alpha啟動子。

2.如權利要求1所述原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的表達方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)構建特異識別靶序列TALEN質粒；

2)設計并構建Donor質粒，所述Donor質粒的左右同源臂之間包括順序串聯的第二啟動子及篩選標記基因；

3)將步驟1)和2)構建的TALEN質粒和Donor質粒轉入受體細胞，通過同源重組對受體細胞進行基因組改造，培養受體細胞并根據篩選標記篩選獲得陽性結果并驗證。

3.如權利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的表達方法，其特征在于，步驟1)中，所述TALEN質粒所針對的靶位點位于靶基因的啟動子與其基因起始序列之間；步驟2)中，所述Donor質粒對應的同源重組靶序列位于靶基因的啟動子與其基因起始序列之間。

4.如權利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的表達方法，其特征在于，所述篩選標記基因為抗性基因和熒光蛋白標記基因。

5.如權利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的表達方法，其特征在于，所述Donor質粒的左右同源臂之間，篩選標記基因之后，還順序插入有終止序列及可誘導的啟動子。

6.如權利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的表達方法，其特征在于，所述Donor質粒的左右同源臂之間包括順序串聯的CMV啟動子、puromycin抗性基因和EGFP熒光蛋白標記基因；所述左右同源臂之間，EGFP熒光蛋白標記基因之后可選擇地順序插入有BGH和SV40兩種終止序列以及Ptight啟動子。

7.如權利要求6所述原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的表達方法，其特征在于，所述puromycin抗性基因和EGFP熒光蛋白標記基因之間插入有T2A序列。

8.如權利要求1-7中任一權利要求所述的表達方法的用途，為用于原位激活長非編碼RNA基因CCAT1-L的過表達，從而應用于LncRNA的功能研究領域。