[發明專利]一種動態調控蘇氨酸外排轉運蛋白基因表達生產L-蘇氨酸的方法

有效

• 申請號: 201410050917.2
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN104845995B
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 溫廷益;劉樹文;梁勇;劉茜;溫際富
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了一種動態調控蘇氨酸外排轉運蛋白基因表達生產L?蘇氨酸的方法本發明提供了一種構建重組菌的方法，包括如下步驟：將突變蘇氨酸操縱子thrA^C1034TBC表達元件、阻遏蛋白基因表達元件和蘇氨酸外排基因表達元件導入目的菌中，得到重組菌；所述蘇氨酸外排基因表達元件包括蘇氨酸外排基因、驅動該基因表達的誘導型啟動子和位于二者之間的調控元件Ocmt。本發明的有益效果在于，根據基因表達對發酵對數期和穩定期蘇氨酸生產的具體作用，有針對性的提出了蘇氨酸外排轉運蛋白基因的表達控制策略，開辟并且實踐證明了新的提高蘇氨酸的發酵量的方式，從而在實踐上可用于細菌發酵生產蘇氨酸，便于推廣應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，屬于氨基酸發酵領域，具體涉及一種動態調控蘇氨酸外排轉運蛋白基因表達生產L-蘇氨酸的方法。

背景技術

L-蘇氨酸是一種人體必需氨基酸，廣泛應用于醫藥、食品、動物飼料等方面。近年來，國內外市場對L-蘇氨酸的需求量逐年增長。

發酵法是目前工業化生產L-蘇氨酸的主要方法，而高生產性能菌種的構建是發酵生產蘇氨酸的關鍵。在菌種構建的過程中，普遍采用過表達蘇氨酸操縱子的方法增強蘇氨酸的合成途徑。當胞內蘇氨酸產量積累到一定濃度時，胞內高濃度的蘇氨酸會反饋阻遏和抑制蘇氨酸合成途徑的關鍵酶，甚至激活蘇氨酸的降解途徑。蘇氨酸外排則成為限制蘇氨酸高效合成的步驟，因此需要加速蘇氨酸向胞外轉運，進一步提高菌種的蘇氨酸生產性能。在公開的文獻中已經鑒定出多種蘇氨酸外排轉運蛋白基因，如大腸桿菌的蘇氨酸外排蛋白基因rhtA、rhtB和rhtC，谷氨酸棒桿菌的thrE基因等。在已公開的蘇氨酸發酵生產技術中，通過簡單的過表達上述蘇氨酸外排轉運蛋白基因可以提高蘇氨酸的產量。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種構建重組菌的方法。

本發明提供的方法，為如下A或B：

A所示的方法包括如下步驟：將阻遏蛋白基因表達元件和蘇氨酸外排基因表達元件導入出發細菌中，得到重組菌；

B所示的方法包括如下步驟：將阻遏蛋白基因表達元件、蘇氨酸外排基因表達元件和突變蘇氨酸操縱子表達元件導入出發細菌中，得到重組菌；

所述蘇氨酸外排基因表達元件包括蘇氨酸外排基因、驅動蘇氨酸外排基因表達的誘導型啟動子和位于二者之間的調控區；

所述阻遏蛋白基因表達元件包括阻遏蛋白基因及驅動阻遏蛋白基因表達的啟動子；

所述突變蘇氨酸操縱子表達元件包括突變蘇氨酸操縱子和驅動突變蘇氨酸操縱子表達的啟動子。

上述方法中，

B所示的方法中，所述導入方式為如下1）或2）：

1）將所述阻遏蛋白基因表達元件、所述蘇氨酸外排基因表達元件和所述突變蘇氨酸操縱子表達元件通過重組載體A導入出發細菌中，得到重組菌；

2）將所述阻遏蛋白基因表達元件和所述蘇氨酸外排基因表達元件通過重組載體B導入出發細菌中，且將所述突變蘇氨酸操縱子表達元件通過同源重組導入所述出發細菌中，得到重組菌。

上述方法中，1）中，所述重組載體A為將所述阻遏蛋白基因表達元件、所述蘇氨酸外排基因表達元件和所述突變蘇氨酸操縱子表達元件插入表達載體中得到的載體；

2）中，所述重組載體B為將所述阻遏蛋白基因表達元件和所述蘇氨酸外排基因表達元件插入表達載體中得到的載體；

所述同源重組為將突變蘇氨酸操縱子表達元件以含有突變蘇氨酸操縱子表達元件的片段的形式同源重組到所述出發細菌中。

上述方法中，所述蘇氨酸外排基因為rhtC或rhtC和rhtB或rhtC、rhtB和rhtA；