[發明專利]生產L?組氨酸的方法及其專用重組菌有效

申請號：	201410050868.2	申請日：	2014-02-14
公開（公告）號：	CN104845923B	公開（公告）日：	2018-03-23
發明（設計）人：	溫廷益;商秀玲;張蕓;劉樹文;梁勇	申請（專利權）人：	中國科學院微生物研究所
主分類號：	C12N1/21	分類號：	C12N1/21;C12P13/24;C12R1/15
代理公司：	北京紀凱知識產權代理有限公司11245	代理人：	關暢
地址：	100101 北***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	生產組氨酸方法及其專用重組
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及氨基酸發酵領域，具體而言，本發明涉及生產L-組氨酸的方法及其專用重組菌。

背景技術

L-組氨酸是人和動物的第九種必需氨基酸，參與機體生長發育、抗氧化和免疫調節等重要的生理過程，是重要的藥用氨基酸，可用于心臟病、貧血、胃腸潰瘍治療的輸液制劑。目前，L-組氨酸生產主要采用以豬（牛）血粉為原料的蛋白質水解提取法，然而，蛋白質水解提取法存在原料成本高且利用率低、提取工藝復雜和環境污染大等缺點，使得L-組氨酸的生產成本高，價格昂貴。微生物發酵法生產L-組氨酸尚未得到大規模的工業化應用。L-組氨酸的生物合成具有與核苷酸合成競爭前體物質、復雜的代謝調控機制以及合成過程中高能量需求等特點，導致其工程菌的產酸水平和轉化率相對較低。L-組氨酸生產菌株的選育主要采用多輪傳統誘變篩選和在誘變菌株的基礎上進行基因工程改造的方法。通過誘變篩選獲得的菌株會積累大量的負效應突變，導致菌株生長緩慢、環境耐受性降低以及營養需求增高等問題。這些缺陷限制了菌株的工業化應用。目前通過系統代謝工程改造構建L-組氨酸工程菌的研究僅有一篇報道。該研究是以野生型大腸桿菌MG1655為出發菌，通過在hisG基因中引入E271K突變，減弱組氨酸對其反饋抑制調節；敲除組氨酸合成操縱子的轉錄弱化因子hisL，上調組氨酸合成操縱子的表達；同時敲除purR基因，增加組氨酸合成前體PRPP的合成，構建了一株產L-組氨酸的工程菌。該研究只進行了L-組氨酸終端合成途徑的改造，其L-組氨酸的產量僅為4.9g/L，與實現工業化應用存在較大差距。

通過失活糖酵解途徑的6-磷酸葡萄糖異構酶，能夠將碳代謝流導向戊糖磷酸途徑，但會導致菌株的生長和葡萄糖代謝能力的減弱而不利于菌株在發酵生產中的應用。前期的研究結果證實，敲除6-磷酸葡萄糖異構酶編碼基因pgi導致菌株的生長和葡萄糖代謝能力的嚴重下降，同時L-組氨酸產量也隨之下降。另外，還發現單獨提高6-磷酸葡萄糖脫氫酶的表達量，對于L-組氨酸產量提高的效果不佳。

發明內容

本發明的目的是提供生產L-組氨酸的方法及其專用重組菌。

本發明提供的構建重組菌的方法，包括如下步驟：降低出發菌中6-磷酸葡萄糖異構酶的表達，且提高所述出發菌中6-磷酸葡萄糖脫氫酶和PRPP合成酶的表達，得到重組菌。

上述方法中，所述降低出發菌中6-磷酸葡萄糖異構酶的表達通過如下A）或B）方式實現：

A）失活所述出發菌染色體的pgi基因；所述失活具體為敲除；

B）將所述出發菌中的pgi基因的調控元件替換為低轉錄和低表達活性的調控元件實現；

所述提高所述出發菌中6-磷酸葡萄糖脫氫酶和PRPP合成酶的表達通過如下C）或D）方式實現：

C）增加所述出發菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷貝數；

D）將所述出發菌染色體上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操縱子的啟動子替換為P_eftu啟動子，且將所述出發菌染色體上的prsA基因的啟動子替換為P_sod啟動子。

上述方法中，所述構建重組菌的方法為如下Ⅰ或Ⅱ：

Ⅰ所示的方法為敲除所述出發菌染色體的pgi基因，且增加所述出發菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷貝數，得到重組菌；

Ⅱ所示的方法為敲除所述出發菌染色體的pgi基因，將所述出發菌染色體上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操縱子的啟動子替換為P_eftu啟動子、且將所述出發菌染色體上的prsA基因的啟動子替換為P_sod啟動子。