[發明專利]利用QCM傳感器檢測玉米褪綠斑駁病毒的方法及專用金片

無效

• 申請號: 201410049532.4
• 申請日: 2014-02-13
• 公開（公告）號: CN103792352A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 黃新;徐江敏
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種利用QCM傳感器檢測玉米褪綠斑駁病毒的方法及專用金片。

背景技術

玉米褪綠斑駁病毒(Mazie?chlorotic?mottle?virus，MMCMV)是正單鏈RNA，其為直徑30nm二十面體，它屬于玉米褪綠斑駁病毒屬，番茄叢矮病毒科的一員。它嚴重危害小麥、大麥、高粱、燕麥等多達15-19種禾本科植物的生長。玉米褪綠斑駁病毒廣泛分布于阿根延、美國等歐美國家以及非洲的5個國家，由于其分布廣泛，傳入我國的的風險逐步加大。如果田間發現有病植株后，其可經昆蟲介體、種子攜帶等方式快速傳播，誘發大面積玉米發病，玉米葉片會出現褪綠斑駁等癥狀，從而導致嚴重的經濟損失。

現階段玉米褪綠斑駁病毒的主要檢測方法有ELISA、實時熒光RT-PCR等。這些傳統的方法在檢測MMCMV時都有一定的缺陷，ELISA操作復雜，耗時長，檢測結果受到實驗用品、操作過程等影響；實時熒光RT-PCR易產生污染影響實驗結果。隨著技術的發展，石英晶體微天平（Quartz?Crystal?Microbalance，QCM）以其無標記、高靈敏度且快速的優點作為生物傳感器越來越多的應用于疫病的檢測中。

發明內容

本發明的目的是提供一種制備用于檢測病毒的QCM金片的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：

1）用巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片，得到修飾后金片；

2）將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測所述病毒的QCM金片。

上述方法中，QCM金片為單側鍍金片，12mm×20mm，單側鍍金50nm，BioNavis公司，貨號QSX301-Au-13052。

步驟1）中，所述巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片按照如下方法制備：將所述QCM金片浸泡在含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中；

步驟1）中，所述浸泡為4℃浸泡12h；

步驟2）中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片為將所述抗病毒抗體與所述修飾后金片上的巰基十一酸和3-巰基丙酸通過酰胺鍵連接。

上述方法中，

步驟1）中，所述含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比為1:1-1:10，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比具體為1:1、1:5或1:10。

上述方法中，

所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比為1:10。

上述方法中，

所述巰基十一酸在所述溶液中的終濃度為0.9mM；

所述3-巰基丙酸在所述溶液中的終濃度為9mM。

上述方法中，

步驟2）中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片按照如下方法制備：先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液活化所述修飾后金片表面的巰基十一酸和3-巰基丙酸的羧基基團；再滴加所述抗病毒抗體，以固定抗體；再將BSA封閉，得到用于檢測所述病毒的QCM金片；

步驟2）中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片具體按照如下方法制備：先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修飾后金片表面，常溫（25℃）下靜置2小時；再滴加所述抗病毒抗體，37℃反應3小時；再滴加濃度為1mg/mL?BSA，25℃下靜置1小時，得到用于檢測所述病毒的QCM金片；

含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亞胺）和Sulfo-NHS（N-羥基硫代琥珀酰亞胺）的溶液：用分析天平稱取一定量的EDC和Sulfo-NHS溶于100μL?MES溶液，振蕩均勻，使EDC在溶液中的濃度為表2所示，NHS在溶液中的濃度為表2所示。現用現配。

MES（脂肪酸甲酯磺酸鹽）溶液：稱取3.90g?MES溶于180mLddH₂O，調節pH至5.0，定容到200mL。

所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩爾比為4-5：1；

所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩爾比具體為5：1。

上述方法中，

所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC的終濃度為0.075M，且Sulfo-NHS的終濃度為0.015M。

上述方法中，

所述抗病毒抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，所述抗病毒抗體具體為單克隆抗體；

所述病毒具體為玉米褪綠斑駁病毒。