[發(fā)明專利]甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410049070.6
• 申請日: 2014-02-12
• 公開（公告）號: CN103766222A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設計）人: 吳衛(wèi);唐鑫;宋倫;楊昭;李興嬌;曾建威;何曉洪;陳艾萌
• 申請（專利權）人: 四川農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發(fā)明涉及甜葉菊的組織培養(yǎng)繁殖方法及其培養(yǎng)基，尤其是涉及以甜葉菊葉片為外植體直接成芽的組織培養(yǎng)快繁方法及其培養(yǎng)基。

背景技術

菊科植物甜葉菊Stevin?rebaudiann，Bertoni，以下稱甜葉菊，是原產(chǎn)于南美洲巴拉圭的菊科甜葉菊屬多年生草本植物，由于甜葉菊所含的甜菊糖苷有制血糖、降低血壓、促進新陳代謝以及治療糖尿病、肥胖癥、調(diào)節(jié)胃酸、恢復神經(jīng)疲勞的功效，并且物理、化學性質(zhì)穩(wěn)定，無發(fā)酵性特點，其制品有比較長的保質(zhì)期，特別適合作為糖尿病、高血壓等病患者食品的甜味劑、保健品添加劑等，具有廣闊的市場前景和應用范圍。

自我國于20世紀70年代年引種甜葉菊并成功擴大種植以來，已經(jīng)有30余年的歷史，但由于甜菊的繁育特性，傳統(tǒng)的繁殖方式包括種子、扦插方式。但是用種子繁育的方法，成活率低；而扦插繁殖導致品質(zhì)退化，并且這兩種繁育方式時間長、需要大量以莖尖、帶腋芽的莖段、種子等材料。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述技術問題，本發(fā)明提供一種新的繁育方式和培養(yǎng)基，采用葉片為外植體，通過組織培養(yǎng)技術，并在不經(jīng)歷愈傷組織培養(yǎng)的階段直接出芽成苗，大大縮短培養(yǎng)時間，且外植體來源受限小，增殖率高，短期內(nèi)可獲得大量種苗。具體的技術方案為：

甜葉菊組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)外植體采集

對于室外栽培的植株，選取無病、蟲損害的甜葉菊植株，采摘植株頂端第一、二對已經(jīng)完全展開，但未老熟的葉片作為外植體；

對于無菌組培苗，可使用長勢良好、健康的組培苗的所有葉片；

(2)消毒接種

采摘自室外栽培植株的葉片用流水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用75％酒精處理6～8秒后再用0.1％升汞浸泡8分鐘，倒去升汞溶液，用無菌水沖洗4～5次，每次不少于半分鐘，然后用無菌紙吸干表面水分并避免相互重疊，并接種到增厚誘導培養(yǎng)基中；

組培苗葉片可不經(jīng)消毒，在無菌條件下采摘后直接接種；

接種時將完整的葉片正面接觸增厚誘導培養(yǎng)基表面，若接種時葉片還存有葉柄，則將葉片基部彎曲，葉柄插入增厚誘導培養(yǎng)基，并保持葉片接觸培養(yǎng)基；

(3)增厚誘導培養(yǎng)

葉片接種到增厚誘導培養(yǎng)基上后，培養(yǎng)至7～9天后葉片出現(xiàn)肉質(zhì)增厚，葉片肉質(zhì)增厚特征表現(xiàn)為，葉片增厚，表面密布透明顆粒，葉片質(zhì)地脆而易斷；

(4)出芽成苗

將第(3)步所得的肉質(zhì)增厚葉片轉(zhuǎn)接進入出芽成苗誘導培養(yǎng)基，在無菌培養(yǎng)室內(nèi)，先完全遮光暗培養(yǎng)1周，再光培養(yǎng)1～2周后，葉片開始在中脈兩側(cè)或葉尖長出紫紅色的芽，每片葉片出芽個數(shù)約8～14個，每一個芽經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后顏色轉(zhuǎn)綠，并單獨成一株再生苗，待苗生長至高3～5cm后進入下一步驟；

(5)轉(zhuǎn)接生根

將3～5cm高的苗相互分開成單株，保證每株苗有葉片5～7枚，轉(zhuǎn)接插入配置好的生根誘導培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)約3周后，苗基部長出多條綠色根，并有明顯白色根毛后，進行下一步驟；

(6)煉苗移栽

將生根的苗連同培養(yǎng)容器一同移出無菌培養(yǎng)室，在控制溫度為正常室溫的育苗室內(nèi)放置2～3天后，揭開培養(yǎng)容器蓋子或封口膜再放置2～3天，期間保持育苗室內(nèi)濕度在80％以上，之后用清水洗凈根上附著的培養(yǎng)基，移栽入噴灑過多菌靈500倍液的室外土壤中，并保持土壤濕潤。

其中，所述的增厚誘導培養(yǎng)基包括：MS+芐基腺嘌呤6-BA?0.1～1.0mg/L+萘乙酸NAA?0.1～0.5mg/L+0.7％瓊脂。

增厚誘導培養(yǎng)基優(yōu)選成分包括：MS+芐基腺嘌呤6-BA?0.4mg/L+萘乙酸NAA?0.1mg/L+0.7％瓊脂。

所述的出芽成苗誘導培養(yǎng)基包括：MS+萘乙酸NAA?0.4～1.0mg/L+芐基腺嘌呤6-BA?1.0～2.5mg/L+0.7％瓊脂。

出芽成苗誘導培養(yǎng)基優(yōu)選成分包括：MS+萘乙酸NAA?0.5mg/L+芐基腺嘌呤6-BA?2.0mg/L+0.7％瓊脂。

所述的生根誘導培養(yǎng)基包括：1/4MS+吲哚丁酸IBA?0.05～0.2mg/L+萘乙酸NAA?0.05～0.2mg/L+0.5％瓊脂。

生根培養(yǎng)基優(yōu)選成分包括：1/4MS+吲哚丁酸IBA?0.2mg/L+萘乙酸NAA?0.2mg/L+0.5％瓊脂。

增厚誘導培養(yǎng)基、出芽成苗誘導培養(yǎng)基、生根誘導培養(yǎng)均在121℃溫度下滅菌20分鐘，并在滅菌前調(diào)整pH值為5.6～5.8，培養(yǎng)溫度控制為23±1℃，光照10～12小時/天，使用照度為1800～2000Lx的日光燈源。