[發明專利]突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網膜疾病診斷試劑中的應用

有效

• 申請號: 201410047797.0
• 申請日: 2013-01-07
• 公開（公告）號: CN104004826A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 趙晨;陳雪;趙堪興;陳雪娟;潘鑫源;蔣超
• 申請（專利權）人: 趙晨
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

分案說明

本申請系2013年1月7日提交的申請號為2013100052529，名稱為一種篩查HRDs致病突變的方法及涉及的基因芯片雜交探針設計方法的中國發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網膜疾病診斷試劑中的應用。

背景技術

遺傳性視網膜疾病(Hereditary?retinal?diseases,HRDs)是一組由遺傳缺陷引起的進行性視網膜退行性疾病，是臨床上常見且危害嚴重的遺傳性致盲疾病。作為世界范圍內工作年齡人群的第一大致盲眼病，HRDs在歐美發病率約為1/3000，在我國更是高達1/1000。我國是HRDs遺傳資源大國，但目前HRDs相關的遺傳學信息多來自西方國家，因此對我國HRDs患者進行深入的遺傳學研究顯得尤為重要。

HRDs多為單基因遺傳病，眾多基因缺陷均可導致其發生，其常見的遺傳模式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X連鎖隱性遺傳。迄今，全世界已鑒定出191個HRDs相關致病基因和231個連鎖位點(www.RetNet.org)，且隨著研究深入，該數目正逐年遞增。其致病基因數之多表明臨床表現相同的患者，很有可能有不同的基因型，即顯著的遺傳異質性。目前仍有大于60%(西方國家統計結果，我國比率更高)HRDs患者的致病基因尚未找到，提示存在大量新致病基因有待挖掘。

由DNA轉錄得到的前體RNA(pre-mRNA)需經過剪接成為信使RNA(mRNA)才能進一步參與翻譯過程合成蛋白質，而該剪接過程主要發生在剪接體。剪接體是由小分子核糖核蛋白(snRNPs)組成的超大分子復合體，構成剪接體的snRNP有五種：U1、U2、U4/U6和U5。研究指出，與前體RNA剪接體蛋白編碼相關的基因(剪切基因)能夠引起常染色體顯性視網膜色素變性(ADRP)。目前已被證實能夠引起ADRP的剪切基因有PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RP9以及由申請人所發現并報道的SNRNP200，這些剪切基因都是通過影響U4/U6-U5復合體而引起ADRP的。值得關注的是，上述六個剪切基因所編碼的蛋白在生物體各種細胞內廣泛表達，但目前研究僅發現該六個基因相關的突變能夠引起視網膜疾病，沒有引起其他疾病的報道。因此，針對剪切基因與RP發病的相關研究顯得尤為必要。

針對HRDs的研究必須建立在一定的分子生物學技術的基礎上。研究HRDs致病基因的一個重要目的是進行HRDs分子診斷，鑒于其顯著的遺傳異質性，如何檢測眾多致病基因突變是目前的難題之一。基于連鎖分析的定位克隆策略是鑒定單基因遺傳病致病基因的經典方法，但是同時也面臨一些困難：①通常需要多代家系，難以分析小家系和散發病例。②有時多代家系也不能定位致病位點。③難以在連鎖區域內篩選出正確的致病基因。因此，鑒于HRDs疾病本身的性質及傳統分析技術的局限性，尋求一種全新的HRDs致病基因的研究方法顯得尤為迫切。

發明內容

本發明的目的是針對上述缺陷，提供突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網膜疾病診斷試劑中的應用。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種以深度測序為平臺篩查或檢測HRDs致病突變所涉及的基因芯片雜交探針的設計方法，包括：

(1)候選基因的選擇:所述的基因捕獲芯片涵蓋了全部179個由RetNet公布的視網膜疾病相關基因，及高度懷疑可能與視網膜疾病相關的剪切基因；

(2)轉錄本的選擇：針對不同基因選擇特定轉錄本，選擇原則是：首先考慮擁有CCDS編碼蛋白的轉錄本，若一個基因有多個轉錄本均編碼蛋白，則首選含氨基酸數最多的蛋白相對應的轉錄本，若多個轉錄本氨基酸含量相同，則進一步選擇含堿基數最多的轉錄本；

(3)雜交探針的設計：根據(2)中挑選出的不同轉錄本設計雜交探針，設計標準為：(a)探針覆蓋所有候選基因的外顯子區域及外顯子和內含子拼接處；(b)去除在人類基因組中出現的高度重復序列及出現2-5倍的較低頻率的重復片段；(c)對臨近外顯子的探針進行整合，整合標準為：當相鄰外顯子的綜合目標區域總和小于600bp時，即將其整合為一個探針，以求通過一對探針完成多對外顯子區域的捕獲；其中，所述的相鄰外顯子的綜合目標區域指前個外顯子的上游100bp起至后一個外顯子的下游100bp止；(d)當所設計探針序列小于250bp時，在其兩端各包含上下游100bp的內含子的基礎上，各繼續增加相同bp數的內含子，使探針大小達到250bp。